草果多酚物质提取及LC-MS/MS分析

李志君,万红焱,顾丽莉,韩 毅,郑亚丽,张梦晓,刘文婷

(昆明理工大学化学工程学院,云南昆明 650500)

草果多酚物质提取及LC-MS/MS分析

李志君,万红焱,顾丽莉*,韩 毅,郑亚丽,张梦晓,刘文婷

(昆明理工大学化学工程学院,云南昆明 650500)

对提油后的草果粉末进行了多酚提取工艺优化,多酚成分分析及抗氧化活性研究。在单因素实验的基础上,选取提取时间、料液比、乙醇浓度、提取温度进行了四因素三水平的Box-Behnken中心组合研究,运用Design Expert 8.06软件对实验数据进行分析;利用LC-MS/MS对多酚物质进行定性;通过DPPH自由基清除法和ABTS自由基清除法检测了草果多酚的抗氧化活性。实验结果表明,草果多酚最佳提取工艺条件为:提取时间150 min、料液比1∶30 g/mL、乙醇浓度60%、提取温度67 ℃、多酚提取得率为9.69%;同时,从草果中检测出6种(原儿茶酸、对羟基苯甲酸、香草酸、芦丁、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、3,5-二-C-β-D-吡喃葡萄糖基根皮素)文献已报道的多酚类物质和4种(龙胆酸、原花青素B2、金丝桃苷、木樨草素-7-O-β-D-葡萄糖苷)文献未报道的多酚类物质;该草果多酚具有一定的DPPH、ABTS自由基清除能力,IC50值分别为42.46 μg/mL和85.47 μg/mL,且多酚浓度与其抗氧化活性正相关。

草果多酚,提取,响应面,LC-MS/MS分析,抗氧化活性

草果(Amomumtsaoko)又名草果仁、草果子,为姜科豆蔻属多年生常青丛生草本植物,是中国传统的药食两用的中药材,广泛分布于我国云南、广西、贵州、四川等地[1-4]。目前国内外对草果的研究主要集中于挥发油的提取和成分分析,而对草果多酚的研究少之又少,特别是对提取挥发油后的草果粉末没有进一步利用,造成原料的浪费。关于植物中多酚提取的研究很多,常用的提取方法有超临界流体萃取、微波萃取、传统溶剂提取等。超临界流体萃取操作条件稳定,没有溶剂残留,安全环保,但提取率较低,设备成本高;微波萃取虽然提取率高,但对设备要求高,生产成本也相对较高;传统溶剂提取法对设备要求低,操作简单,提取效果稳定,已广泛用于科研和实际生产中。所以本实验采用一定浓度的乙醇溶液提取草果中的多酚类物质。本实验应用精度高、周期短的响应面实验设计法[5]优化了超临界流体萃取挥发油后的草果粉末中多酚的提取工艺,并利用高效液相色谱仪及Q ExactiveTMFocus组合型四极杆Orbitrap质谱仪对其多酚成分进行定性分析,还通过DPPH、ABTS自由基清除率及SPSS 19.0软件对多酚的抗氧化活性进行研究。研究内容为多酚类物质提供了新的来源,也为抗氧化剂的开发提供了一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

草果 云南省怒江州泸水县;乙腈、甲醇(色谱纯) 默克股份两合公司;乙醇、没食子酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、2,2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐等 均为分析纯。

Ultimate3000液相色谱仪、Q ExactiveTMFocus质谱仪 美国Thermo Scientific;LXJ-ⅡB高速离心机 上海安亭科学仪器厂;HH-4电热恒温水浴锅 金坛市杰瑞尔电器有限公司;BSA224S电子天平 赛多利斯科学仪器有限公司;RHP-600高速多功能粉碎机 浙江荣浩工贸有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 没食子酸标准曲线的绘制 配制0、20、40、60、80 和 100 μg/mL的没食子酸标准溶液[6],分别取上述不同浓度的没食子酸标准溶液0.5 mL,加入20%的福林酚试剂2.5 mL,摇匀,静置5 min,加入7.5 g/100 mL的碳酸钠溶液2 mL,室温下避光反应60 min后,用分光光度计于765 nm波长下测吸光值。以标准工作液的浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制没食子酸标准曲线。吸光度值Y与没食子酸标准溶液质量浓度X(μg/mL)之间的回归关系为:Y=0.0061X+0.0314,R2=0.9981。

1.2.2 草果果实多酚的提取 草果果实于40 ℃下烘干至恒重,粉碎后过50目标准筛,然后进行超临界CO2提油实验,具体工艺参照本课题组前期发表的文献[7]。本实验称取经超临界CO2流体萃取挥发油后的草果粉末0.2 g,按照一定的提取时间、料液比、乙醇浓度、提取温度进行溶剂提取后,离心取上清液进行多酚含量测定,并计算多酚提取得率。

草果果实多酚提取得率的计算公式:

式(1)

式中:E为草果多酚的提取得率(%);c为提取液中草果多酚的含量(g/mL);v为样品液定容的体积(mL);n为提取液的稀释倍数;m为草果粉末质量(g)。

1.2.3 草果果实多酚提取的单因素实验 采取渐变式优化法,分别研究提取时间、料液比、乙醇浓度和提取温度对草果果实多酚提取得率的影响。具体实验步骤为:在料液比1∶25 g/mL、乙醇浓度60%、提取温度70 ℃的条件下,研究提取时间(30、60、90、120、150 min)对草果多酚提取得率的影响;在提取时间120 min、乙醇浓度60%、提取温度70 ℃的条件下,考察料液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45 g/mL)对草果多酚提取得率的影响;在提取时间120 min、料液比1∶35 g/mL、提取温度70 ℃的条件下,考察乙醇浓度(30%、40%、50%、60%、70%、80%)对草果多酚提取得率的影响;在提取时间120 min、料液比 1∶35、乙醇浓度50%的条件下,考察温度(40、50、60、70、80、90 ℃)对草果多酚提取得率的影响。

1.2.4 草果果实多酚提取的响应面法实验设计 在单因素实验的基础上,采用Design-Expert 8.0.6软件[8],根据Box-Benhnken中心组合设计原理,选取温度(℃)、萃取时间(min)、料液比(g/mL)、乙醇浓度(%)四个因素为自变量,以草果提取液中的多酚含量为指标设计响应面实验,对实验数据进行回归分析。实验因素水平设计见表1。

表1 Box-Benhnken实验设计因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Benhnken design

1.2.5 草果果实多酚的定性研究 色谱条件:色谱柱为Hypersil Gold C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.9 m,美国Thermo Fisher公司);流动相A为0.1%甲酸水溶液,B为乙腈溶液,流速200 μL/min;进样量10 μL。梯度洗脱程序:0.00～1.00 min,95% A;1.00～15.00 min,95% A～40% A;15.00～16.00 min,40% A～5% A;16.00～17.00 min,5% A;17.00～18.00 min,5% A～95% A;18.00～20.00 min,95% A。

质谱条件:离子化方式:电喷雾电离负离子模式(ESI-);喷雾电压:3.2 kV;蒸发温度:350 ℃;离子传输管温度280 ℃;鞘气(N2)压力为30 bar;扫描范围:m/z 100～1000,扫描分辨率:35000。碎裂方式:高能量碰撞(CID),能量35%。

1.2.6 草果果实多酚的抗氧化活性的测定 参照Blois[9]测定DPPH自由基清除能力、Re[10]测定ABTS自由基清除能力的方法,测定草果果实多酚提取液的抗氧化活性。以VC做阳性对照实验。

1.3 数据处理

所有实验重复测定3次,各项指标的数据均用Origin 8.5软件处理作图。运用Design Expert 8.06软件和SPSS 19.0软件对实验数据进行分析。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 提取时间对草果多酚提取得率的影响 实验结果如图1所示,多酚提取得率随提取时间增加而上升,在120 min达到最大值(8.62%)后,继续增加提取时间,多酚提取得率却有所下降。这说明,在一定范围内增大提取时间有利于草果中多酚物质充分溶解于提取液中,但提取时间过长,可能使得浸出的多酚物质被氧化或被降解[11],从而导致多酚提取量的降低。因此采用120 min为最佳提取时间。

图1 提取时间对草果多酚提取得率的影响Fig.1 Effect of time on extraction yield of polyphenols from Amomum tsaoko

2.1.2 料液比对草果多酚提取得率的影响 实验结果如图2所示,随着料液比减小,多酚提取得率不断增加,主要是因为减小料液比在一定程度上提高了传质推动力[12]。当料液比达到1∶35 g/mL之后,多酚提取得率开始下降,说明多酚物质在提取液中的溶解度已基本达到饱和,继续减小料液比,多酚提取量也许会增加,但其提取得率却会减少。由此选取1∶35 g/mL为最佳料液比。

图2 料液比对草果多酚提取得率的影响Fig.2 Effect of ratio of solvents to raw material on extraction yield of polyphenols from Amomum tsaoko

2.1.3 乙醇浓度对草果多酚提取得率的影响 实验结果如图3所示,随着提取液中乙醇浓度的增加,草果多酚的提取得率先增加后减少,当乙醇浓度达到50%时,多酚提取得率最高。这是因为草果中多酚类物质多以氢键与蛋白质、多糖等物质形成稳定的分子结构,乙醇浓度过低,不足以破坏草果中多酚类物质与其它物质的氢键或其它作用力,多酚提取液的含量低[13]。若乙醇浓度过高,脂溶性成分溶出过多,不利于多酚类物质的溶解,也会降低多酚提取得率。因此选择50%为最佳乙醇浓度。

图3 乙醇浓度对草果多酚提取得率的影响Fig.3 Effect of concentration of ethanol on extraction yield of polyphenols from Amomum tsaoko

2.1.4 提取温度对草果多酚提取得率的影响 实验结果如图4所示。随着温度升高,草果多酚提取得率先增大后减小,当温度达到60 ℃时,多酚含量达到最大值。温度升高,多酚物质的溶解度和在提取液中的扩散系数增加,其提取得率增加,但温度过高,会造成多酚物质一定程度的降解[14],特别是当温度达到90 ℃时,提取液沸腾蒸发,损失很大。因此选择60 ℃为最佳提取温度。

图4 提取温度对草果多酚提取得率的影响Fig.4 Effect of temperature on extraction yield of polyphenols from Amomum tsaoko

2.2 响应面优化实验

运用Design-Expert 8.0.6对表2实验数据进行多元回归拟合,获得响应值多酚提取得率(Y)与4个因素二次多项式的回归模型为:Y=9.09-0.012A+0.52B-0.42C-0.62D-8.455×10-3AB-0.27AC+0.36AD+0.37BC+0.66BD-0.95CD-0.41A2-0.11B2-0.27C2-0.55D2。

表2 实验设计方案及结果Table 2 Experimental design and results

表3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

注:**表示影响极显著(p≤0.01);*表示影响显著(p<0.05)。

由表3可知,模型方程一次项B、C、D项极显著,A项不显著,且从F值看出影响因素的大小顺序为:D>B>C>A,即乙醇浓度>时间>料液比>温度;二次项A2、C2、D2极显著,B2不显著;交互项AC、AD、BC、BD、CD极显著,AB不显著,A、B、C、D及其交互作用对响应值的影响见图5。

如图5所示,对各因素做响应面图与等高线图可看出,料液比和温度、乙醇浓度和温度、料液比和时间、乙醇浓度和时间、乙醇浓度和料液比的响应面图中曲线较陡且等高线图接近椭圆,说明交互作用对提取效果的影响均较显著;温度和时间的响应面图中曲线较平滑且等高线图接近圆形,说明交互作用对草果中多酚提取量影响不显著,这与回归分析的结果吻合。

图5 两因素间的交互作用对多酚提取得率的响应面图Fig.5 Response surface plots of variable parameters on the yield of polyphenol

运用Design Expert 8.0.6软件,以草果中多酚提取得率较大为目标,得出优选实验条件为:提取温度67.39 ℃、提取时间150 min、料液比1∶30 g/mL、乙醇浓度60%,在此条件下,多酚提取得率可达到9.94%。在最佳条件下(参数调整为提取温度67 ℃、时间150 min、料液比1∶30、乙醇浓度60%)平行实验三次,得出的提取得率平均值为9.69%±0.33%,和上述模型预测出的值接近,实际测得的提取得率与理论预测值的相对偏差为2.5%,因此采用响应面法得到的最佳条件准确可靠。

2.3 草果多酚的定性研究

目前,草果中已报道[16]的多酚类物质总共有9种,包括:原儿茶酸、对羟基苯甲酸、香草酸、芦丁、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、3,5-二-C-β-D-吡喃葡萄糖基根皮素、2-甲氧基-1,4-二苯酚-1-O-[6-O-(3-甲氧基-4-羟基苯甲酰基)]-β-D-吡喃葡萄糖苷、邻苯二酚、邻苯三酚。

表4 多酚化合物的质谱数据Table 4 Mass spectrometric data of polyphenol compounds

注:S:确定的多酚种类;G:猜测所含多酚种类。

通过质谱图谱检索可得到前6种多酚类物质,同时发现了4种草果果实中可能存在的未经报道过的多酚类物质,见表4。

S1:Protocatechuic acid碎片离子153.01808与张协光等[17]所报道一致(千分位);碎片离子108.02022与报道109.02895不完全相符,推测是其在质谱负离子模式下脱去一个质子得到的,并且从分子结构方面考虑,Protocatechuic acid脱去羧基即可得到碎片离子108.02022。

S2:P-hydroxy benzoic acid碎片离子137.02309及93.03310与宓捷波等[18]所报道一致(千分位),且王暐等[16]曾报道过,草果中含有P-hydroxy benzoic acid,因此判断S2为P-hydroxy benzoic acid。

表5 四种新物质碎片离子峰的归属与说明Table 5 Fragment peak assignment and commentin of four new polyphenols

表6 多酚提取液对DPPH和ABTS自由基清除率的回归结果Table 6 Regression results of DPPH and ASTS radical scavenging activities of polyphenol

图7 草果多酚和VC的ABTS自由基清除能力Fig.7 ABTS radical-scavenging activities of VC and polyphenols from Amomum tsaoko

LC-MS/MS分析确定了草果果实中6种多酚类物质,同时发现4种可能存在未经报道过的多酚类物质;另外,实验证明草果多酚还具有一定的DPPH自由基与ABTS自由基清除能力,且多酚浓度与其抗氧化活性正相关。

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S3:Vanilloid二级碎片离子123.00747;108.02013与张协光等[17]所报道一致(千分位),而碎片离子152.01004与宓捷波等[18]所报道一致(千分位),说明此三个碎片离子都是PVanilloid的二级碎片离子,而且是第一次同时被检测出。因此判断S3为Vanilloid。

S4:Rutin二级碎片离子271.02518;300.02713与孔祥虹等[19]所报道一致,碎片离子301.03381与李辰辰等[20]所报道一致。且一级碎片离子609.14624与文献均一致。因此判断S4为Rutin。

S5:Quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside碎片离子463.08774和301.03308与王暐等[16]报道过的一致。另外,推测碎片离子301.03308是由碎片离子463.08774失去一个脱水葡萄糖而得。

S6:3,5-di-C-β-D-glucopyranosylphloretin碎片离子597.18207与王暐等[16]所报道一致;本次新测得的碎片离子417.11865是由3,5-di-C-β-D-glucopyranosylphloretin脱去一个质子,脱去一个葡萄糖单元得到的。因此判断S6为3,5-di-C-β-D-glucopyranosylphloretin。

根据物质的结构式及其裂解规律,分析猜测草果中可能还含有Gentisic(龙胆酸)、Procyanidin B2(原花青素B2)、Hyperoside(金丝桃苷)、Luteolin-7-O-β-D-glucoside(木樨草素-7-O-β-D-葡萄糖苷)4种多酚类物质,其二级质谱图碎片离子峰的归属及说明见表5。

2.4 草果多酚的抗氧化活性

由图6、图7和表6可知,草果多酚对DPPH和ABTS自由基均有较强的清除能力[21-22],半抑制质量浓度(IC50)分别为42.46 μg/mL和85.47 μg/mL。在所测浓度范围内,草果酚类提取物的DPPH和ABTS自由基清除能力均高于同浓度的VC。

图6 草果多酚和VC的DPPH自由基清除能力Fig.6 DPPH radical-scavenging activities of VC and polyphenols from Amomum tsaoko

3 结论

选用乙醇作为提取液,通过响应面法优化提油后草果粉末中多酚的提取工艺,得到的最佳提取条件为:提取温度67 ℃、时间150 min、料液比1∶30 g/mL、乙醇浓度60%,此条件下多酚提取得率最高为9.69%。四个因素对草果多酚提取得率的影响大小顺序为:乙醇浓度>提取时间>料液比>提取温度;并利用

Extraction and LC-MS/MS analysis of the polyphenols fromAmomumtsaoko

LI Zhi-jun,WAN Hong-yan,GU Li-li*,HAN Yi,ZHENG Ya-li,ZHANG Meng-xiao,LIU Wen-ting

(College of Chemical Engineering,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China)

Extraction processes,component analysis and antioxidant activity of polyphenols from deoilingAmomumtsaokowere studied. Based on single factor experiments,a three-level-four-factor test was arranged to optimize the factorial parameters(extraction time,ratio of solvents to raw material,concentration of ethanol and extraction temperature)by employing Box-Behnken design of response surface methodology,and Design Expert 8.06 software was used to analyze test data. Then LC-MS/MS was used for qualitative analysis of polyphenols. Finally antioxidant activities of the polyphenols were detected by DPPH and ABTS free radical scavenging assay. The optimum extraction conditions were obtained as follows,extraction time 150 min,ratio of solvents to raw materia 1∶30 g/mL,ethanol concentration 60% and extraction temperature 67 ℃. The extraction yield was 9.69% under the conditions. At the same time,six kinds(protocatechuic acid,p-hydroxy benzoic acid,vanilloid,rutin,quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside and 3,5-di-C-β-D-glucopyranosylphloretin)of polyphenols were identical with those the reported in literature,and four kinds(gentisic,procyanidinB2,hyperoside and luteolin-7-O-β-D-glucoside)of polyphenols,which had not been reported in literature,were found in the extract fromAmomumtsaoko. The polyphenol had some DPPH free radica and ABTS free radica scavenging capacity,IC50values were 42.46 μg/mL and 85.47 μg/mL respectively,and the antioxidant activity was positively correlated with polyphenol concentration.

polyphenols ofAmomumtsaoko;extraction;response surface design;LC-MS/MS analysis;antioxidant activity

2016-10-14

李志君(1992-)，女，硕士研究生，主要从事天然产物的分离与提纯方面的研究，E-mail:junandxin666@163.com。

*通讯作者:顾丽莉(1963-)，女，教授，主要从事化学工程方面的研究，E-mail:liligu001@163.com。

国家自然科学基金资助项目(20966004)。

TS255.1

B

1002-0306(2017)08-0294-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.049