超声与微波辅助提取陈皮中橙皮苷及其抗氧化性研究

黄 智,肖 南

(华南农业大学食品学院,广东广州 510642)

超声与微波辅助提取陈皮中橙皮苷及其抗氧化性研究

黄 智,肖 南*

(华南农业大学食品学院,广东广州 510642)

将超声波与微波辅助提取法进行对比,旨在确定具有较高提取效率的提取陈皮中陈皮苷的方法,同时评价橙皮苷提取物的抗氧化活性。以1年制陈皮为原材料,橙皮苷为检测指标,考虑料液比、提取时间、提取功率三个因素,通过正交实验优化超声波和微波辅助提取橙皮苷的条件。结果表明,超声波辅助提取橙皮苷的最优工艺条件为:料液比1∶50、超声波时间25 min、超声波功率80 W,在该条件下橙皮苷得率是8.06%±0.02%;而微波辅助提取橙皮苷的最优工艺条件为:料液比1∶50、微波时间40 s、微波功率为240 W,在该条件下橙皮苷的提取率为8.12%±0.04%。相比于超声辅助提取法,微波辅助提法提取时间短,且提取率高,因此采用微波辅助提取法提取橙皮苷是较有效的方法。通过三种抗氧化体系分析橙皮苷抗氧化活性,结果显示橙皮苷对有机自由基DPPH·、羟自由基·OH有一定的清除作用,对Fe3+也有一定的还原能力。

超声波,微波,橙皮苷,抗氧化性

作为柑橘生鲜产品的副产品,陈皮有巨大食用药用价值,但目前国内陈皮资源的开发利用仍处于发展阶段。橙皮苷是陈皮中最主要的功能性成分,具有抗过敏、降血压、抑制癌变和抗病毒等作用[1-2]。鉴于橙皮苷显著的生物活性,其提取工艺是当前食品、医药等行业研究的热点。橙皮苷传统提取方法主要有有机溶剂提取法[3]、碱提酸沉法[4]、酶解[5]等方法。近年来,超声、微波辅助提取技术因具有高效、快速、节省时间和能源等优点在生物活性物质萃取领域取得了显著进展,橙皮苷的超声及微波辅助提取法[6-7]也得到了广泛的应用与研究。李雪谊等[8]采用超声波辅助提取柑橘皮中的橙皮苷,通过正交实验得到最佳提取工艺:料液比30 mL/g、提取温度60 ℃、超声功率240 W、超声时间30 min,在最佳工艺下所得橙皮苷含量高且实验重复性好。孙秀利等[9]运用微波法从陈皮中提取橙皮苷,在最佳工艺下橙皮苷提取率可达到2.40%,同时与传统热回流提取法进行对比,表明微波法具有缩短提取时间且节省生产成本的优点。超声波与微波辅助提取法虽然都具有较高的提取效率,但关于比较两者提取效率的研究目前尚少。因此,本文将超声波与微波辅助提取法进行对比,旨在确定具有较高提取效率的提取方法,同时评价橙皮苷提取物的抗氧化活性,为橙皮苷生产机械化、专业化、创新化提供理论基础,提高陈皮的经济价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1年陈皮 广州东鹏特饮有限公司;橙皮苷标准对照品 上海如吉生物科技有限公司;维生素C、水杨酸 广州牌化学试剂;无水乙醇 天津市富宇精细化工有限公司;七水合硫酸亚铁、三氯化铁 广州牌化学试剂;三吡啶三吖嗪(TPTZ) 北京索莱宝科技有限公司;其他试剂 均为国产分析纯。

CFT-100 100 g手提式高速中药粉碎机 温岭市林大机械有限公司;UV-1800 岛津紫外分光光度计 日本岛津仪器有限公司;G8023CSL-K3微波炉 佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司;SCIENTZ-ⅡD超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技有限公司;DHG-9053BS-Ⅲ电热恒温鼓风干燥箱 上海新苗医疗器械制造有限公司;Centrifuge 5804R 台式高速离心机 德国艾本德(中国)股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 橙皮苷的提取 陈皮→烘干→粉碎→过60目筛→准确称量1.0000 g陈皮→加70%乙醇溶解→搅拌→静置30 min→移入超声波/微波反应系统→4000r/min离心10 min→减压抽滤→橙皮苷提取物→稀释100倍→284.0 nm 波长处测吸光度。

1.2.2 样品中橙皮苷提取率计算公式

1.2.3 橙皮苷标准曲线绘制 准确称取橙皮苷标准品0.0100 g 移入100 mL容量瓶中,用70%乙醇配制成浓度为0.1 mg/mL的母液。从中分别取出1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的母液,移入10 mL的具塞试管中,用70%乙醇稀释至刻度,分别得到质量浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL的标准样液。用紫外-可见分光光度计在284.0 nm波长下测定标准样液的吸光度,以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.4 超声辅助提取法

1.2.4.1 超声辅助提取法单因素实验 根据预实验结果,分别考虑以下单因素:

在超声功率60 W,超声时间5 min,分别选择1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60料液比进行实验;

在料液比1∶30,超声时间5 min的条件下,分别选择60、70、80、90、100 W超声提取功率进行实验;

在超声功率60 W,料液比1∶30的条件下,分别选择5、10、15、20、25 min提取时间进行实验。

1.2.4.2 超声辅助提取法正交实验设计 在单因素实验基础上,以料液比、超声功率、超声时间为实验考察因素,以橙皮苷提取率为评价指标,设计L9(33)正交实验优化提取条件,因素与水平设计见表1。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal test

1.2.5 微波辅助提取法

1.2.5.1 微波辅助提取法单因素实验 根据预实验结果,分别考虑以下单因素:

在微波功率240 W,微波时间60 s的条件下,分别选择1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60料液比进行实验;

在料液比1∶30,微波时间60 s的条件下,分别选择160、240、320、400、480 W微波提取功率进行实验;

在微波功率240 W,料液比1∶30的条件下,分别选择20、40、60、80、100 s提取时间进行实验。

1.2.5.2 微波辅助提取法正交实验设计 在单因素实验基础上,以料液比、微波功率、微波时间为因子,以橙皮苷提取率为评价指标,设计L9(33)正交实验优化提取条件,因素与水平设计见表2。

表2 正交实验因素水平表Table 2 Factors and levels table of orthogonal test

1.2.6 橙皮苷抗氧化性

1.2.6.1 DPPH·自由基清除能力 参照Cotellen[10]的方法稍作修改。用分析天平称量一定量橙皮苷提取物,加入70%乙醇溶液,定容于100 mL容量瓶,分别配制成质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.6 mg/mL的样品待测液,同时制备0.1 mmol/L DPPH·乙醇溶液;取5.6 mL DPPH·溶液与0.4 mL样品混合均匀在暗处放置30 min后于517 nm波长下测吸光值Ai,以70%乙醇溶液为参比获得空白样吸光度A0,每个试样作三次平行实验,取其平均值,代入以下清除率计算公式中获得清除率。以维生素C为阳性对照。清除率计算公式如下:

式中:A0-空白样吸光度;Ai-试样吸光度。

1.2.6.2 ·OH自由基清除能力 参照Fenton反应稍作修改。在试管中分别加入浓度均为10.0 mmol/L水杨酸-乙醇溶液、6.0 mmol/L FeSO4溶液各1.0 mL,分别加入0.1、0.2、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.6 mg/mL样品待测液1.0 mL,添加蒸馏水定容至5.0 mL。再分别加入浓度为6.0 mmol/L H2O2溶液1.0 mL,反应10 min,在波长为510 nm处测吸光度Ai,以70%乙醇溶液为参比获得空白样吸光度A0,每个试样作三次平行实验,取其平均值,代入以下公式中获得清除率，以维生素C为阳性对照。清除率计算公式如下:

式中:A0-空白样吸光度;Ai-试样吸光度。

1.2.6.3 Fe3+还原力 参照Benzie[11]的反应方法稍作修改。分别加入0.1、0.2、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.6 mg/mL样品待测液1.0 mL,再加入4.9 mL FRAP试剂(0.1 mol/L醋酸缓冲液、10 mmol/L TPTZ、20 mmol/L三氯化铁溶液按照10∶1∶1比例配制),在遮光暗处条件下混合均匀,反应10 min后在593 nm波长下测定吸光度Ai。以0.1 mL 70%乙醇溶液为参比获得空白样吸光度A0,每个试样作三次平行实验,取其平均值,代入以下公式获得还原率。以维生素C为阳性对照,判断橙皮苷对铁离子还原的能力。还原计算公式如下:

式中:A0-空白样吸光度;Ai-试样吸光度。

1.3 数据处理

本实验使用Origin 8.5软件对数据作图。

2 结果与分析

2.1 橙皮苷标准曲线

采用橙皮苷为标准品,以不同的标准系列质量浓度为横坐标,以吸光度A为纵坐标绘制标准曲线,橙皮苷质量浓度与吸光度呈很好的线性关系,橙皮苷标准曲线如图1所示。

图1 橙皮苷标准曲线Fig.1 Hesperidin standard graph

2.2 超声辅助提取法

2.2.1 超声辅助提取法单因素实验

2.2.1.1 料液比的单因素实验 由图2可知,当料液比小于1∶50时,随着料液比增大,橙皮苷提取得率显著提高,这是由于提取溶剂的用量增加,溶液中橙皮苷浓度降低,陈皮原料与提取溶剂的接触面积增加,且接触面的浓度差变大,扩散推动力大,提高了传质的速率。当料液比为1∶50时,橙皮苷提取得率趋向于稳定,但料液比的增加会给生产加工后续浓缩纯化等操作带来影响,且费时耗能。因此综合考虑实际操作与生产成本,选择料液比1∶30、1∶40、1∶50三个水平进行正交实验。

图2 料液比对橙皮苷提取得率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extration yield of hesperidin

2.2.1.2 超声功率的单因素实验 由图3可知,随着超声波功率增大,提取得率不断增大,当超声波功率为70 W时橙皮苷得率达到最大值。超声波功率大于70 W,随着超声波功率继续增大橙皮苷提取得率逐渐减少,这是由于高功率可以降解溶出的橙皮苷,导致橙皮苷得率减少。因此选择超声波功率60、70、80 W三个水平进行正交实验。

图3 超声波功率对橙皮苷提取得率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on extration yield of hesperidin

2.2.1.3 超声时间的单因素实验 由图4可知,橙皮苷得率先随着超声波时间的增加而增加,并在超声波时间20 min时橙皮苷得率达到最大值,随后橙皮苷得率开始下降,这是由于橙皮苷在长时间超声处理下发生降解。因此选择超声时间15、20、25 min三个水平进行正交实验。

图4 超声波时间对橙皮苷提取得率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on extration yield of hesperidin

2.2.2 超声辅助提取法正交实验 基于单因素实验结果,以超声波时间、超声波功率、料液比为因子,设计三因素三水平正交实验,结果见表3。

由表3可知,因素对得率影响主次顺序是C>A>B,即超声波时间>料液比>超声波功率。最优组合为A3B3C3,因此最佳提取条件为超声波时间25 min、超声波功率80 W、料液比1∶50。在最佳提取条件下进行验证性实验,测得橙皮苷得率为8.06%±0.02%。齐兵[3]采用有机溶剂热回流萃取法在最佳条件(料液比1∶35,提取时间2.5 h,提取时间85 ℃,乙醇浓度75%)下橙皮苷最大得率为3.31%±0.07%。对比传统有机溶剂萃取法,超声波辅助提取法具有提取时间短并且得率高的优势。

表3 L9(33)正交实验及结果Table 3 L9(33)orthogonal test and results

2.3 微波辅助提取法

2.3.1 微波辅助提取法单因素

2.3.1.1 料液比的单因素实验 由图5可知,橙皮苷提取率先随着提取液用量的增加而增加,这是由于随料液比的增加,陈皮药材得到完全浸润,有效成分充分溶出。当料液比为1∶40 g/mL 时,提取率达到最大值。综合浸出效果和节约溶剂以及降低成本等方面考虑,选择液料比1∶30、1∶40、1∶50 g/mL三个水平进行正交实验。

图5 料液比对橙皮苷提取率的影响Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on extration yield of hesperidin

2.3.1.2 微波功率的单因素实验 由图6可知,随着微波功率增大,提取得率不断增大,当微波功率为240 W时橙皮苷得率达到最大值。微波功率大于240 W,随着微波功率继续增大橙皮苷提取得率逐渐减少,这是由于高功率可以降解溶出的橙皮苷,导致橙皮苷得率减少。因此选择超声波功率160、240、320 W三个水平进行正交实验。

图6 微波功率对橙皮苷提取率的影响Fig.6 Effect of microwave power on extration yield of hesperidin

2.3.1.3 微波时间的单因素实验 由图7可知,橙皮苷的提取率随微波辐照时间的增大而增大,微波时间在60 s时,橙皮苷的提取率达到最大值;此后随着微波时间延长,橙皮苷的提取率呈下降趋势,这是由于微波提取时间过长,橙皮苷可能因长时间反复辐照或受热导致结构发生变化,最终发生分解。因此选择微波提取时间40、60、80 s三个水平进行正交实验。

图7 微波时间对橙皮苷提取率的影响Fig.7 Effect of microwave time on extration yield of hesperidin

2.3.2 微波辅助提取法正交实验 基于单因素实验结果,以微波时间、微波功率、料液比为提取因素,设计三因素三水平正交实验,结果见表4。

由表4可知,由于极差RA>RB>RC,故因素对得率影响主次顺序是A>B>C,即料液比>微波功率>微波时间。最优组合为A3B2C1,因此最佳提取条件为料液比1∶50,微波功率为240 W,微波时间40 s。在最佳提取条件下进行验证性实验,测得橙皮苷得率为8.12%±0.04%。

表4 L9(33)正交实验及结果Table 4 L9(33)orthogonal test and results

2.4 超声与微波辅助提取法的比较

从橙皮苷得率可得,在最优条件下微波辅助提取法提取橙皮苷的得率略高于超声辅助法。伍钢[12]等的研究结果与此相反,其解释是微波使分子间相互摩擦碰撞而产生的高温会促使橙皮苷发生降解,而超声波主要利用空化和机械效应破碎细胞故可避免高温对橙皮苷的破坏。本实验结果可能的原因是,微波辅助提取法所用的微波功率较低,在提取过程中并没有产生较高的温度,此外,微波辅助提法提取时间很短,故温度对橙皮苷降解的影响十分有限。微波辅助提法在很短提取时间内具有较高的提取率,表现出较高的提取效率,因此微波辅助提取法提取橙皮苷是较有效的方法。

2.5 DPPH·自由基清除能力

由图8可知,随着橙皮苷浓度的增加,清除率呈缓慢上升趋势,即橙皮苷浓度与清除率呈现一定的量效关系。在0.1～0.6 mg/mL范围内,当橙皮苷浓度为0.6 mg/mL时,DPPH·的清除率达到最大值。相比之下,维生素C的清除效果非常明显。当样品溶液中维生素C浓度<0.3 mg/mL时,随着维生素C浓度的增加,其对DPPH·的清除率急剧增加;当维生素C浓度>0.3 mg/mL后,维生素C 其对DPPH·清除率增加突然放缓,当维生素C浓度为0.3 mg/mL时清除率已经达到86.45%。由此可见,橙皮苷清除DPPH·的能力明显弱于维生素C。

图8 橙皮苷对DPPH·的清除作用Fig.8 Scavenging effect of hesperidin on DPPH·

2.6 ·OH自由基清除能力

由图9可知,随着橙皮苷浓度的增加,橙皮苷对·OH的清除能力逐渐增强,当橙皮苷浓度为0.6 mg/mL时,其对羟自由基的清除率达到最大值16.79%,即橙皮苷浓度与清除率呈现一定的量效关系。而维生素C的曲线趋势变化则更为明显。当样品溶液中维生素C浓度<0.35 mg/mL时,随着维生素C浓度的增加,其对·OH的清除率急剧增加;当维生素C浓度在0.35～0.45 mg/mL时,随着维生素C浓度的增加,其对·OH清除率增加缓慢。虽然橙皮苷清除·OH的能力明显弱于维生素C,但橙皮苷仍表现出一定清除·OH的能力。黄芳[13]等的研究也有类似结果,其探究了不同浓度橘皮橙皮苷提取液对·OH的清除效果,发现橙皮苷提取液对·OH的半清除率IC50=10.08μg/mL,也证实了橙皮苷具有一定的抗氧化能力。

图9 橙皮苷对·OH的清除作用Fig.9 Scavenging effect of hesperidin on ·OH

2.7 Fe3+还原力实验

由图10可知,随着橙皮苷浓度的增加,橙皮苷对Fe3+的还原能力逐渐增强,即橙皮苷浓度与还原率呈现一定的量效关系,当橙皮苷浓度达到0.6 mg/mL时,吸光度最大,表明其对Fe3+的还原能力最大。与DPPH·和·OH清除曲线一样,维生素C还原Fe3+的曲线趋势变化比橙皮苷更为明显。当维生素C浓度<0.3 mg/mL时,随着维生素C浓度增加,其对Fe3+的还原能力持续增加,并且与橙皮苷对Fe3+还原能力相差无几;当维生素C浓度在0.3～0.45 mg/mL时,随着维生素C浓度增加,其对Fe3+的还原能力急剧增加。由此可见,橙皮苷虽表现出一定还原Fe3+的能力,但与维生素C还原Fe3+能力存在一定差距。

图10 橙皮苷对Fe3+的还原作用Fig.10 Saving effect of hesperidin on Fe3+

3 结论与讨论

通过单因素和正交实验,确定了橙皮苷超声辅助提取法和微波辅助提取法的最优提取条件。超声波辅助提取橙皮苷的最优工艺条件为:超声波时间25 min、料液比1∶50、超声波功率80 W,在该条件下橙皮苷得率是8.06%±0.02%;而微波辅助提取橙皮苷的最优工艺条件为:微波时间40 s、料液比1∶50、微波功率240 W,在该条件下橙皮苷的得率为8.12%±0.04%。从橙皮苷得率可以看出,在最优条件下微波辅助提取法提取橙皮苷的得率略高于超声辅助法且提取时间短,因此微波辅助提取法是橙皮苷较为高效的提取方法。

通过三种抗氧化体系分析橙皮苷抗氧化活性,结果表明橙皮苷对有机自由基DPPH·、羟自由基·OH表现出一定的清除能力,对Fe3+表现出一定的还原能力,但明显弱于维生素C清除自由基及还原铁离子能力。在橙皮苷浓度0.1～0.6 mg/mL范围内,随着橙皮苷浓度的增加,橙皮苷对DPPH·和·OH的清除能力及Fe3+的还原能力均逐渐增强,即橙皮苷浓度均与清除率或还原率呈现一定的量效关系,并在0.6 mg/mL时达到了最大值。由于实验中的橙皮苷未经过纯化处理,经过纯化处理后其抗氧特性应该会进一步提高。由此可见,橙皮苷是一种天然的抗氧化剂,具有广泛的应用前景和开发价值。

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Ultrasound and microwave-assisted extracting hesperidin form citrus and study of its antioxidant activities

HUANG Zhi,XIAO Nan*

(College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)

In this paper,ultrasonic and microwave-assisted extraction methods were compared in order to determine the efficient extraction method,while evaluating the antioxidant activity of hesperidin extract.Single factor and orthogonal design were adopted in the experiments. 1-year dried citrus peel was as raw materials and hesperidin was used as detection index,considering solid-liquid ratio,extraction time and extraction power to compare the two methods of extraction process.The results showed that the optimum process conditions of ultrasound-assisted extraction was solid-liquid ratio 1∶50,ultrasonic time 25 min,ultrasonic power 80 W and under this condition the extraction rate was 8.06%±0.02%. While optimum process conditions of microwave-assisted extraction was solid-liquid ratio 1∶50,microwave time 40 s,microwave power 240 W and under this condition the extraction rate was 8.12%±0.04%.Compared with the ultrasound-assisted extraction,microwave-assisted extraction takes less time and exhibits more effcient extraction rate,so the method of microwave-assisted extraction was regarded as a more effective way.In addition,it was proved that hesperidin had certain scavenging effect on DPPH· and ·OH,and also had certain reduction effect on Fe3+.

ultrasound;microwave;hesperidin;antioxidant activity

2016-09-02

黄智(1992-)，男，硕士研究生，研究方向：畜产品加工与安全控制,E-mail:18289289695@163.com。

*通讯作者:肖南(1979-)，女，硕士，实验师，研究方向：食品加工工艺,E-mail:317617365@qq.com。

广东省省科技计划项目(2013B090600040)。

TS255.1

B

1002-0306(2017)08-0250-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.040