塑化剂影响小鼠乳腺发育的研究

韦 璇 姚依兰 冯 阁 黄凤华 张西锋 鄢又玉

(武汉轻工大学 生物与制药工程学院,湖北武汉 430023)

塑化剂影响小鼠乳腺发育的研究

韦 璇 姚依兰 冯 阁 黄凤华 张西锋 鄢又玉*

(武汉轻工大学 生物与制药工程学院,湖北武汉 430023)

为了探讨塑化剂DEHP对小鼠乳腺发育的影响。本研究通过灌服DEHP的方式处理见栓孕鼠，并利用HE染色、RNA提取及基因芯片分析、基因表达谱的方法，分析了DEHP对小鼠乳腺发育的影响。结果显示：经DEHP处理后，孕鼠乳腺的终端导管数量显著增加，孕鼠乳腺早期发育的基因表达模式被改变。由此表明，DEHP可影响小鼠乳腺的发育。

塑化剂 小鼠 乳腺

塑化剂（邻苯二甲酸（2─乙基己基）二酯，DEHP）是一种有毒的化工业用塑料软化剂。DEHP的分子化学式是C24H38O4，分子量390.56。它是一种油状的、澄清透明的、无色无臭的液体。具有难溶于水，易溶于有机溶剂的性质，可以与多种高分子物质进行良好的液—液互溶。在工业产品中加入DEHP可使微粒分子更均匀散布，从而增加产品的弹性、延展性和柔软度。基于以上优点，DEHP广泛地用于医疗用的输血袋、塑胶手套和医疗设备、胶管、盛装食物的塑胶容器、儿童塑胶玩具、清洁材料和杀虫剂等[1]。大量的消费品和日常用品中都含有DEHP，人们广泛地接触DEHP，其安全性引起人们的关注。

人类终生通过不同的途径接触不同来源的DEHP，它对人体的危害是防不胜防的。DEHP是内分泌干扰物（endocrinedisrupting compounds，EDCs）的一种，可以通过雌激素受体发挥作用[2]。DEHP等内分泌干扰物的暴露会对性腺的发育造成伤害，造成卵巢早衰、卵母细胞发育失败等[3-4]。现有的研究表明，乳腺癌的发生与EDCs的暴露之间具有潜在的相关性，EDCs的暴露会增加出现乳腺癌的风险[5-6]。DEHP作为EDCs的之一，其暴露对妊娠早期孕鼠的乳腺发育和相关基因表达模式的影响值得关注。

本研究以妊娠早期母鼠为研究对象，探讨DEHP暴露对乳腺发育和基因表达模式的影响及其机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

实验小鼠为CD1品系，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验动物房保持每天光照12 h和黑暗12 h交替，湿度35±4%，温度24±1 ℃的条件。

1.1.2 实验材料

实验小鼠的乳腺组织一部分用于HE染色分析，一部分用于RNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 实验小鼠的处理

母鼠见栓后的0.5d到3.5 d期间以0（对照）、20μg/kg、40μg/ kg的剂量每天灌服处理。在3.5d和7.5d时收集孕鼠乳腺组织用于乳腺发育的整体分析和总RNA提取等。

1.2.2 小鼠乳腺组织分离和染色

小鼠经颈椎脱臼法处死后，剥离第四对乳腺，用4%甲醛溶液固定24h；然后用双蒸水冲洗固定的乳腺组织，置于洋红-硫酸铝钾溶液中4℃过夜；再进行乙醇和甲苯的处理，把处理好的乳腺组织浸泡在水杨酸甲酯中，用于体视显微镜观察。

1.2.3 RNA提取及基因芯片分析、基因表达谱的生物信息学分析

小鼠乳腺组织RNA提取方法使用EASYspin Plus 组织/细胞RNA快速提取试剂盒（RN2802，Aidlab，北京）进行总RNA提取和纯化。使用Agilent Bioanalyzer 2100生物芯片分析系统和mouse oligo microarray杂交试验完成芯片杂交试验，结果采用GenePix4.1软件进行分析，连锁层次聚类使用R软件heatmap.2包生成。随后基于DAVID这一基因功能注释数据库进行Gene Ontology分析[7-8]。

2 结果与分析

2.1 DEHP暴露影响孕鼠乳腺的早期发育

为研究在小鼠青春期发育过程中DEHP暴露对其乳腺发育的影响，DEHP处理见栓母鼠在见栓后的第3.5d和第7.5d处死孕鼠，解剖其乳腺，取其第4对乳腺，分析DEHP暴露对孕鼠乳腺发育的影响情况。结果如下。

图1 DEHP暴露刺激CD-1小鼠妊娠早期的乳腺发育

（A）乳腺组织的整体结构图片；（B）和（C）在小鼠妊娠的第3.5d和第7.5d，相于对照组，不同浓度的DEHP暴露孕鼠后乳腺终端导管的相对数量。

如图1B 所示，在3.5d和7.5d时，与对照组相比，经不同浓度DEHP暴露后的孕鼠乳腺组织中具有较多的终端导管。另外，不同浓度DEHP处理孕鼠乳腺组织中也具有较多的边侧分支。对3.5d和7.5d孕鼠乳腺组织中的乳腺导管发育的相对数量进行了定量分析，结果发现：在3.5d时，与对照组孕鼠乳腺相比，2两个不同浓度的DEHP处理组孕鼠乳腺的终端导管数量显著增加（P＜0.05），分别是对照组的1.43±0.09和1.47±0.11倍（图1B）。 在7.5 dpc时，DEHP处理组孕鼠乳腺的终端导管数量相对于对照组同样显著（P＜0.05），分别是对照组的1.20±0.10和1.46±0.13(图1C)。

2.2 DEHP暴露影响孕鼠乳腺细胞的基因表达模式

为了进一步研究DEHP暴露对孕鼠乳腺组织基因表达模式的影响，我们分离了孕鼠乳腺组织并提取了mRNAs进行基因芯片分析。

如图2A所示，散点图代表了信号强度富集倍数的log2比率，黑点代表了对照组和20 μg/kg DEHP处理组乳腺细胞中表达水平相似的基因群，而DEHP处理组中表达上调的基因标成红色，下调的基因标成蓝色。研究发现，总共有25919个基因在孕鼠乳腺细胞中被检测到，其中25582个基因在对照组和20 μg/kg DEHP处理组之间没有显著的表达差异（图2B）。相对于对照组，20 μg/kg DEHP处理组有152个基因表达水平显著上调，185个基因表达水平显著下调（图2B）。表达水平显著变化的337个差异表达基因的层次聚类分析见图2 C。

图2 DEHP暴露孕鼠乳腺组织的基因表达的芯片分析结果

(A)基于基因表达的微阵列数据，DEHP实验组与对照组间基因表达总体模式类似，DEHP处理后上调基因用红色表示，下调基因用蓝色表示 (B) 韦恩图结果显示25582个基因在两组间表达无差异(log|fold change| ＜ 1), 在DEHP处理组中共有152个上调及185个下调显著差异表达基因。(C) 组间差异表达基因的层次聚类分析。

3 讨论

环境中的雌激素类似物可影响动物的乳腺发育和健康[6]。本实验发现短时间、低浓度DEHP暴露可以导致孕鼠乳腺早期发育的基因表达模式的改变，存在潜在的乳腺癌细胞产生的可能性。由此证实了DEHP暴露对孕鼠乳腺细胞发育的潜在危害和影响。目前的研究表明人尿液中的DEHP的平均含量也达到2 mg/day。FDA认为DEHP对成人来说的安全剂量上限是0.04 mg/day/kg，即50公斤体重的成年人每天吸收2mg DEHP是安全的。但本实验的研究发现短期、低剂量接触DEHP即可对孕鼠乳腺的发育产生危害，也证明了短期、低剂量DEHP完全可以影响孕鼠乳腺细胞的基因表达模式。

现有的研究表明，EEs及类似物危害乳腺发育并诱导乳腺癌发生的潜在作用被广泛研究[9]。在怀孕期间接触EEs及其类似物会导致其后代乳腺癌的发病率升高。Paulose等人的研究表明在胎儿时期接触BPA会导致其成年后发生乳腺癌[9]。同样Acevedo的研究也表明仅在孕期和哺乳期暴露BPA也会诱发乳腺癌[10]。由此表明BPA可能是一种致癌剂。Dairkee 等人发展了一个系统培养人类非肿瘤的高危供体乳腺上皮细胞（human non-cancerous high-risk donor breast epithelial cells，HRBECs），发现BPA影响调控该细胞存活、增殖和凋亡的多个检测点的基因表达[11]。Bhan 等人的研究表明，BPA和DES暴露导致人乳腺癌细胞（MCF7）和大鼠乳腺细胞的基因表达发生改变，并且改变了Hotair基因启动子区的表观修饰模式，导致内分泌紊乱[12]。而本研究表明DEHP暴露导致妊娠早期孕鼠乳腺组织中终端导管数量显著增加、乳腺过快发育，也验证了前期个学者的研究。

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项目来源：武汉轻工大学校立项目（2016y30）

韦璇（1994-），男，专业：生物技术。

鄢又玉（1975-），女，博士，讲师。