用CIA模型探讨壮医滚克阳证与阴证动物模型的建立

梁江洪　李凤珍　龙朝阳　钟丽雁　柏春晖　梁艳　蒋桂江　王苑俪

[摘要]目的：以胶原诱导性关节炎（CIA）模型为基础，附加模拟的风、寒、湿、热环境，建立符合壮医病因理论的动物模型。方法：将40只雌性Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、阳证组与阴证组每组各10只，除空白外均采用弗氏不完全佐剂和牛II型胶原蛋白诱导大鼠CAI模型，阳证组在每天附加风、湿、热刺激持续lh，条件控制：风速5m/s，相对湿度90%，温度（37±1）℃；阴证组每天附加风、寒、湿刺激持续1h，条件控制：风速5m/s，相对湿度90%，温度（8±1）℃。比较各组大鼠关节炎-体长温度差值、计算关节炎症积分以及ELISA只测定TNF-a、IL-1B水平的差异结果：阴证组关节-体表温度差值、炎症指数方面均低于阳证组，差异有统计学意义（P<0.05）；阴证组大鼠血清TNF-d、IL-1B水平均低于阳证组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：通过风、寒、湿刺激的CIA大鼠可做为阴证模型的参考，通过风、湿、热刺激的CIA大鼠可做为阳证模型的参考。同时也存在造模复杂化、大鼠死亡率增的缺点，有待进一步完善。

[关键词]动物模型；滚克；类风湿关节炎；阳证与阴证；壮医

类风湿关节炎是临床常见的自身免疫性疾病，其发病机制非常复杂，主要的病理表现为滑膜增生、炎症细胞浸润、血管翳形成并造成软骨和骨质破坏。目前常用CIA模型来研究类风湿关节炎的发病机制，但该模型的发生机制目前尚无定论，可以肯定：免疫系统对CⅡ的高度敏感性是该模型建立的主要原因，细胞和体液免疫均参与了病理过程。类风湿关节炎在壮医的病名为滚克，缘由风、寒、湿、热毒侵袭人体，阻滞三道两路而致病，临床辨证分为阳证、阴证。本研究尝试以CIA模型为基础，附加模拟的风、寒、濕、热环境，建立符合壮医病因理论的动物模型，为后续相关动物实验提供参考。

1.材料和造模

1.1实验材料 SPF级雌性Wistar大鼠（生产许可证：SCXK2014-0002），体重（110±20）g，购自广西中医药大学实验动物中心。牛Ⅱ型胶原蛋白（批号：150230）、弗氏不完全佐剂（批号：150207）、IL-1B（批号：1006-63）、TNF-a试剂盒（批号：1100-86）购于北京博蕾德生物科技有限公司。

1.2造模箱制作 参考文献自制造模箱，以自行改装的空调系统控制箱内温度，以超声雾化器雾化灭菌水控制箱内湿度，以鼓风机提供风源。

1.3CIA大鼠造模方法 在无菌条件下，用0.1moL/L冰醋酸充分溶解牛II型胶原蛋白，制成浓度为4mg/L溶液，再按1：1体积与弗氏不完全佐剂混合、震荡并充分乳化，制成CⅡ乳剂，保存于4℃冰箱备用。试验时每只大鼠CII乳剂0.25mL于颈、背、尾部分多点皮内注射致炎（初次免疫），于7d后按上述方法再次免疫。

2.实验分组及方法

40只大鼠，适应性饲养7d后，随机选30只按上述方法造模，造模成功后再随机分为模型组、阳证组、阴证组，每组10只；余下10只未造模大鼠为空白组。均于室温（恒温（20±2）℃，相对湿度50%～60%）下正常喂养。阳证组在首次接受胶原蛋白注射开始同时每天给予风、湿、热刺激持续1h，条件控制：风速5m/s，相对湿度90%，温度（37±1）℃；阴证组在首次接受胶原蛋白注射开始同时每天给予风、寒、湿刺激持续1h，条件控制：风速5m/s，相对湿度90%，温度（8±1）℃。

3.观察和指标

3.1关节-体表温度差值 各组大鼠以最肿胀关节体表温度与腹部体表温度差值进行比较。体表温度测量方法，于室温下，相同时间点用非接触式红外测温仪在相同的距离内测量。

3.2关节炎症积分 采用关节炎指数积分法评定，评定依据为关节红肿程度和范围以及关节肿大和变形情况。0分：无关节炎；1分：有红色斑点或轻度肿胀；2分：关节部位中度肿胀；3分：关节严重肿胀；4分：关节严重肿胀且不能负重。每个肢体最高积分为4分，每只鼠最高积分为16分。

3.3血清TNF-a、IL-1B含量 于第1次胶原蛋白注射后的第22天，水合氯醛麻醉各组大鼠，腹主动脉采血，分离血清待测，未测的血清放入-4℃低温冰箱保存。IL-1B、TNF-a均采用ELISA法，按照试剂盒说明书进行。

4.统计学处理

数据分析采用SPSS19.0软件处理，计量资料采用均数加减标准差（x±s）表示，组问比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

5.结果

5.1关节表面-体表温差 关节表面-体表温差（简称差值）比较，空白组大鼠膝关节表面温度均低于体表温度，与模型组比较，差值明显增高，差异有统计学意义（P<0.01）。阴证组差值小于模型组，差异有统计学意义（P<0.01），表明阴证组关节表面温差低于模型组；阳证组差值与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05），表明阳证组关节表面温差与模型组相当；阴证组差值与阳证组比较，差异有统计学意义（P<0.05），表明阴证组关节表面温差低于阳证组。见表1。

5.2关节炎症指数 空白组炎症指数为0，与模型组比较，炎症指数增高，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，阳证组关节炎症指数差异无统计学意义（P>0.05），阴证组关节炎症指数小于模型组，差异具有统计学意义（P<0.05），表明阴证组关节炎症程度低于模型组。与阳证组比较，阴证组关节炎症指数小于阳证组，差异有统计学意义（P<0.05），表明阴证组关节炎症指数小于阳证组。见表1。

5.3炎症因子 与空白组比较，模型组TNF-a、IL-1B值均明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，阳证组TNF-a、IL-1B统计学差异（P>0.05），阴证组TNF-a、IL-1B值小于模型组，差异有统计学意义（P<0.05），表明阴证组TNF-a、IL-1B水平低于模型组。与阳证组比较，阴证组TNF-a、IL-1B值小于阳证组，差异有统计学意义（P<0.01），表明阴证组TNF-a、IL-1B水平明显低于阳证组。见表2。

6.结论

本研究结果表明，阴证组关节一体表温度差值、炎症指数方面均低于阳证组（P<0.05），阴证组大鼠血清TNF-a、IL-1B水平均低于阳证组（P<0.05）。表明在比较成熟的CIA模型基础上，附加风、寒、湿、热等外界刺激，会对模型大鼠产生影响：通过风、寒、湿刺激的模型大鼠可做为阴证模型的参考；通过风、湿、热刺激的模型大鼠可做为阳证模型的参考。同时，结果表明，阳证组与模型组在表温度差值、炎症指数、血清TNF-0L和IL-1B水平方面无统计学意义（P>0.05），可说明CIA急性期多表现为阳证。本研究探索在CIA模型基础上建立壮医滚克病因学说中的阴、阳两证模型取得初步成效，同时也存在造模复杂化、大鼠死亡率增高的缺点，有待进一步完善。