外源ABA和Ca2+对低温及低温恢复下赤霞珠幼苗蔗糖代谢的影响

姜寒玉，王旺田，雷天翔，何百，张金林

(1.甘肃农业大学生命科学技术学院， 甘肃 兰州 730070； 2.中国科学院西北高原生物研究所, 青海 西宁 810008；3.甘肃紫轩酒业公司， 甘肃 嘉峪关 735100； 4.兰州大学草地农业科技学院， 甘肃 兰州 730020)

外源ABA和Ca2+对低温及低温恢复下赤霞珠幼苗蔗糖代谢的影响

(1.甘肃农业大学生命科学技术学院， 甘肃 兰州 730070； 2.中国科学院西北高原生物研究所, 青海 西宁 810008；3.甘肃紫轩酒业公司， 甘肃 嘉峪关 735100； 4.兰州大学草地农业科技学院， 甘肃 兰州 730020)

为了明确外源ABA及Ca2+处理对低温条件下酿酒葡萄蔗糖代谢的影响，以赤霞珠幼苗为试验材料，研究了在不同浓度ABA和Ca2+条件下，5℃低温及5℃低温后25℃恢复(5℃和5℃/25℃)两种条件下碳水化合物积累及蔗糖代谢关键酶活性的变化。结果表明：两种处理条件下，随着外源ABA和Ca2+浓度的逐渐升高，植株内蔗糖, 果糖, 葡萄糖和淀粉含量不断增加，并且在5 mg·L-1ABA或15 mmol·L-1CaCl2浓度处理下植株内碳水化合物含量积累至最高，依次较对照增加了67.88%，21.8%，213.77%，7.04%，51.38%，2.35%，8.84%，31.81%或72.81%，35.37%，123.57%，36.44%，25.90%，28.67%，210.56%，210.90%。其中ABA处理后的葡萄糖含量在5℃/25℃条件下较5℃显著增加。两种处理条件下，外源ABA及CaCl2提高了赤霞珠幼苗蔗糖合成酶(SS)，蔗糖磷酸合成酶(SPS)，酸性转化酶(AI)，中性转化酶(NI)活性，其中在5 mg·L-1ABA或15 mmol·L-1CaCl2处理下4种蔗糖代谢关键酶活性显著增高，依次较对照提高了64.10%，125.00%，193.29%，756.31%，2 291.51%，1 569.31%，1 523.13%，1 336.77%或26.42%，20.38%，30.75%，58.30%，111.63%，14.14%，14.32%，66.39%。说明适宜浓度的ABA及Ca2+处理可增强蔗糖代谢酶活性，促进蔗糖转化，提高碳水化合物含量，从而增强幼苗的抗寒能力。研究结果为酿酒葡萄糖代谢物质及相关酶在外源ABA及Ca2+处理下响应低温机理提供理论依据。

酿酒葡萄；ABA；Ca2+；低温；室温恢复；蔗糖代谢

低温影响植物生长, 发育和产量的形成，而低温胁迫下植物能够通过感知刺激和信号传导，从而启动各种防御机制来响应低温[1]。ABA和Ca2+作为细胞的第二信使在植物的生长发育及对逆境的应答反应中具有重要的作用[2-5]。研究发现外源ABA能够提高植株内源ABA的合成水平，诱导抗寒基因的表达及冷信号的传递，增强超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)等保护性酶的活性，增加可溶性糖和可溶性蛋白等渗透调节物质的含量，最终增强植物的抗冷性[6-7]。

Ca2+是植物生长发育的必需元素之一，是植物抗偶联胞外信号与胞内生理反应的第二信使，在提高植物抗冷性上可能有两方面作用，一是通过稳定细胞壁，细胞膜结构和提高保护酶活性以增强植物的抗冷力，二是通过传递低温信息诱导抗冷基因的表达以提高植物的抗冷力[8-10]。

可溶性糖是一种重要的渗透调节物质，其在植物体内积累有利于植物抗冷性的提高，对适应低温逆境起着重要的调节作用，可作为抗冷性的鉴定指标[11]。可溶性糖主要由果糖，蔗糖和葡萄糖组成，这些糖类物质在体内的转换积累量与代谢相关酶的活性有关。而参与糖代谢的关键酶有转化酶(酸性转化酶AI和中性转化酶NI)，蔗糖合成酶(SS)及蔗糖磷酸合成酶(SPS)[12]。

葡萄是具有优良食用品质和酿酒特性的多年生藤本落叶果树，其栽培面积和产量长期位居世界水果生产首位[13]。我国的酿酒葡萄产业近年来发展迅速，其中西北地区的酿酒葡萄种植面积逐年增加，但该地区的春冷和冬寒对葡萄生长造成严重伤害。如西北地区的酿酒葡萄主载品种赤霞珠抗寒性差，通常采用冬季下架埋土, 春季出土的越冬方式，费时费工。因此低温已上升为影响西北地区葡萄产业迅速发展的瓶颈问题。目前，有关低温条件下ABA和Ca2+对酿酒葡萄蔗糖代谢影响的研究尚未见报道。本研究以酿酒葡萄赤霞珠幼苗为材料，在低温及室温恢复条件下测定酿酒葡萄幼苗的蔗糖，果糖，葡萄糖，淀粉含量及SPS，SS，NI和AI的活性，探讨低温条件下外源ABA和Ca2+与酿酒葡萄蔗糖代谢的关系，旨在为ABA和Ca2+调控酿酒葡萄蔗糖代谢应答低温的作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料处理

将生长健壮的赤霞珠茎段接种在GS培养基上，待长至10 cm左右时，继代接种于不同浓度ABA(1，2，5 mg·L-1)和CaCl2(5，15 mmol·L-1)的去Ca2+的GS培养基上，置于光照强度200 μmol·m-2·s-1，光照时数16 h/d的光照培养箱中。待长至5～6片叶时，分为两种处理条件：5℃低温处理24 h(低温处理，5℃)；5℃低温处理24 h后25℃室温恢复24 h(低温恢复处理，5℃/25℃)，分别测定幼苗可溶性糖含量及蔗糖代谢酶的活性变化。对照为培养基中不加ABA和CaCl2生长的赤霞珠幼苗，培养条件同前。每个处理3个重复，每个重复6株幼苗。

1.2 试验方法

本研究测定了反映赤霞珠抗寒性的可溶性糖及蔗糖代谢关键酶活性等生理指标。蔗糖，葡萄糖，果糖含量的测定均参照蔡武成等的试验方法[14]，SS活性测定参照Douglas[15]和Tsai-Mei[16]的方法，SPS活性测定参照Wardlaw[17]和Yu[18]的方法，AI和NI活性测定参照Nielsen[19]的试验方法，淀粉含量的测定选用碘显色法[20]。

1.3 数据分析

采用SPSS 16.0等分析软件处理实验数据。

2 结果与分析

2.1 外源ABA对低温及低温恢复下赤霞珠幼苗可溶性糖含量的影响

对照植株的蔗糖，葡萄糖和果糖含量在5℃/25℃处理条件下较5℃分别增加了44.01%，208.87%和62.99%。在5℃低温条件下，5 mg·L-1ABA处理较1 mg·L-1和2 mg·L-1ABA处理，植株内蔗糖含量显著增加了64.79%和45.90%(图1A)，葡萄糖含量则显著增加了147.90%和103.26%(图1B)，果糖含量显著增加了59.32%和46.87%(图1C)。此外，除果糖外，蔗糖和葡萄糖含量经ABA处理后较对照均显著增加。

注：不同处理不同字母表示差异显著(P<0.05)。下同。Note: Different treatments with the different letters mean significant difference by Duncan's test atP<0.05. The same as below.

图1 不同浓度ABA对低温及低温恢复下赤霞珠幼苗可溶性糖含量的影响

Fig.1 Influence of soluble sugar contents on Cabernet sauvignon plantlet under low-temperature and low-temperature-recovery with different ABA concentrations

在5℃/25℃处理下，2 mg·L-1和5 mg·L-1ABA处理较1 mg/LABA处理蔗糖含量显著增加，增幅分别为222.61%和244.15%(图1A)，葡萄糖含量则显著增加了41.35%和76.88%(图1B)，果糖含量显著增加了191.57%和200.99%(图1C)。此外，三种可溶性糖含量经1 mg·L-1和2 mg·L-1ABA处理后较对照显著降低，而在5 mg·L-1ABA处理下除葡萄糖外二者无显著差异。

总体而言，赤霞珠植株在两种处理条件下，蔗糖，果糖和葡萄糖均呈现一致的变化趋势(图1)。说明外源ABA的加入可以显著提高低温条件下赤霞珠幼苗内蔗糖，果糖和葡萄糖含量，而对低温恢复条件下上述指标无显著影响。

2.2 外源Ca2+对低温及低温恢复下赤霞珠幼苗各种糖含量的影响

对照植株在5℃/25℃处理下蔗糖，葡萄糖和果糖含量均增加，其含量分别增加了45.43%，182.62%和61.78%。5℃低温条件下，5 mmol·L-1CaCl2处理蔗糖含量较对照有所降低，但15 mmol·L-1较5 mmol·L-1CaCl2处理蔗糖含量增加了155.22%(图2A)，差异显著，而葡萄糖和果糖含量的变化相似，随CaCl2浓度的增加而增加，15 mmol·L-1CaCl2处理和5 mmol·L-1CaCl2处理葡萄糖含量较对照增幅为123.58%和29.27%(图2B)，果糖含量较对照增幅分别为25.89%和8.72%(图2C)。

图2 外源CaCl2对低温及恢复下赤霞珠幼苗各种糖含量的影响

Fig.2 Influence of soluble sugar contents of Cabernet sauvignon plantlet under low-temperature and low-temperature-recovery with different CaCl2concentrations

5℃/25℃条件下15 mmol·L-1CaCl2处理较5 mmol·L-1CaCl2处理蔗糖含量增幅为70.57%(图2A)，葡萄糖含量增幅为221.35%(图2B)，果糖含量增加154.10%，比对照增加28.67%(图2C)，但5 mmol·L-1CaCl2处理较对照蔗糖，葡萄糖，果糖含量均有所降低(图2)。

综上所述，高浓度CaCl2(15 mmol·L-1)处理后，可以显著提高低温及低温恢复条件下赤霞珠幼苗枝条内葡萄糖和果糖含量，从而增强赤霞珠幼苗抗寒性。

2.3 外源ABA和Ca2+对低温及低温恢复下赤霞珠幼苗淀粉含量的影响

在ABA和Ca2+处理下，对照植株5℃/25℃条件下淀粉含量较5℃低温处理显著增加，增幅分别为153.45%和145.88%。5℃条件下，2 mg·L-1和5 mg·L-1ABA处理比1 mg·L-1ABA处理增加了126.53%和149.49%，但差异不显著(P>0.05)；5℃/25℃条件下，5 mg·L-1ABA处理比1 mg·L-1和2 mg·L-1ABA处理幼苗淀粉含量分别增加了345.98%和224.69%，差异显著(P<0.05)，但均低于对照(图3A)。在不同CaCl2处理条件下，5℃及5℃/25℃条件下淀粉含量变化趋势相同，随着培养基中CaCl2浓度的增加植株淀粉含量增加，15 mmol·L-1CaCl2处理较对照淀粉含量分别增加了210.47%和211.05%，较对照均达显著水平(P<0.05)(图3B)。

图3 外源ABA和CaCl2对低温及低温恢复下赤霞珠幼苗淀粉含量的影响

Fig.3 Influence of starch contents of Cabernet sauvignon plantlet under low-temperature and low-temperature-recovery in different ABA and CaCl2concentrations

2.4 外源ABA对低温及低温恢复下赤霞珠幼苗蔗糖代谢相关酶活性的影响

AI，NI，SS和SPS活性随着ABA浓度的升高而升高，当ABA浓度达到5 mg·L-1时蔗糖代谢相关酶AI，NI，SS和SPS活性达到最大(图4)。5℃处理下，对照植株较低温恢复处理，NI活性显著升高，增幅为182.11%(图4B)，AI活性在ABA为5 mg·L-1时较1 mg·L-1和2 mg·L-1分别增加30.61%和24.27%(图4A)，NI活性增加565.79%和353.13%(图4B)。

5℃/25℃条件下AI活性较低温条件下升高，升高幅度在7.65%～72.27%，1 mg·L-1ABA处理较对照差异不显著，2 mg·L-1和5 mg·L-1ABA较1 mg·L-1ABA处理AI活性增幅为37.93%和109.02%(图4A)。而在ABA低浓度时5℃/25℃条件下NI活性低于5℃而在ABA高浓度下高于5℃。在不同ABA浓度下5℃/25℃处理NI活性的变化与5℃低温条件呈相同趋势，5 mg·L-1ABA处理比1 mg·L-1和2 mg·L-1ABA处理的增幅分别为698.39%和300.04%(图4B)。

SS活性在5℃/25℃条件下低于低温条件，但均高于对照，特别是5 mg·L-1ABA处理后，两种条件下SS活性显著增加，分别高达蔗糖55.09 mg·g-1·h-1和44.13 mg·g-1·h-1FW，比对照增加了2 291.32%和1 569.06%(图4C)。

5℃低温和5℃/25℃两种条件下，对照，1 mg·L-1和2 mg·L-1ABA处理间植株SPS活性变化均无显著差异。但经5 mg·L-1ABA处理后，两种条件下SPS活性显著增加，分别高达蔗糖38.77 mg·g-1·h-1和35.54 mg·g-1·h-1FW，比对照增加了1 523.02%和1 336.70%(图4D)。

图4 外源ABA对低温及低温恢复下赤霞珠幼苗蔗糖代谢相关酶活性的影响

Fig.4 Influence of the activities of sucrose metabolism enzymes in Cabernet sauvignon plantlet under low-temperature and low-temperature-recovery at different ABA concentrations

2.5 外源Ca2+对低温及低温恢复下赤霞珠幼苗蔗糖代谢相关酶活性的影响

对照植株在5℃/25℃处理比5℃低温处理AI和SS活性分别增加了43.96%和36.93%，而NI和SPS活性降低，降低幅度分别为62.39%和8.75%。5℃处理下，随着CaCl2浓度的升高，AI的活性增强，各处理间差异显著，15 mmol·L-1CaCl2处理较对照AI活性增加了26.42%。5℃/25℃条件下，15 mmol·L-1CaCl2处理比对照AI活性增加了20.38%，但5 mmol·L-1较对照减少，差异显著(图5A)。

NI，SS和SPS活性在低温及5℃/25℃条件下变化趋势一致，NI，SS呈现先降后升趋势，SPS活性则随CaCl2浓度的不断升高而增加(图5B，C，D)。CaCl2浓度的升高显著影响NI和SS活性的变化，5 mmol·L-1CaCl2处理均使NI和SS的活性较对照有所降低，而15 mmol·L-1CaCl2处理后，两种条件下NI和SS活性显著增加，较对照NI活性分别增加30.75%和58.3%，而SS活性分别增加111.63%和14.14%(图5B，C)。但5℃低温条件下SPS活性变化差异不显著，而5℃/25℃条件下，5 mmol·L-1CaCl2和15 mmol·L-1CaCl2处理较对照SPS活性显著增加，分别高达蔗糖2.747 mg·g-1·h-1和3.729 mg·g-1·h-1FW，比对照增加了22.58%和66.39%(图5D)。

3 讨 论

3.1 外源ABA和CaCl2对低温及低温恢复下赤霞珠幼苗各种糖和淀粉含量的影响

ABA在适应环境变化如低温及其它胁迫响应中发挥主要作用[21-22]。Ca2+作为偶联胞外信号与胞内生理反应的第二信使，具有调节植物细胞对低温逆境反应和适应性的重要作用[23]。有研究探讨茶树叶片对低温适应性反应时发现，一定浓度的外源ABA能够提高叶片内可溶性糖的含量，从而增强其抗寒性[24]。此外在低温胁迫下，50 μM和15 μM ABA处理能够显著提高黄瓜幼苗水苏糖，棉籽糖和蔗糖的含量。本研究显示，赤霞珠幼苗在5℃低温条件下，随着外源ABA和CaCl2浓度的逐渐升高，植株内蔗糖，果糖，葡萄糖含量均不断增加，说明一定浓度的外源ABA和CaCl2促进了渗透调节物质蔗糖，果糖和葡萄糖的积累，提高了赤霞珠的抗冷性，同时在5 mg·L-1ABA或15 mmol·L-1CaCl2浓度处理下葡萄植株内糖含量积累至最高水平。

图5 外源Ca2+对低温及低温恢复下赤霞珠幼苗蔗糖代谢相关酶活性的影响

Fig.5 Influence of sucrose metabolism enzyme activities of Cabernet sauvignon plantlet under low-temperature and low-temperature-recovery in different CaCl2concentrations

研究发现，低温及恢复培养对番茄的光合作用和蔗糖代谢具有一定影响，其中淀粉，果糖，葡萄糖，蔗糖和总糖的含量显著增加[25]。本研究在低温恢复条件下，ABA或CaCl2作用下的蔗糖含量均低于低温条件，说明在低温恢复过程中，呼吸作用增强，有更多的蔗糖转化为葡萄糖和果糖；而在高浓度的ABA或CaCl2处理下，淀粉，葡萄糖和果糖含量均高于低温，说明ABA或CaCl2在低温处理下糖含量的积累并未对恢复培养阶段产生反馈抑制。表明外源ABA和CaCl2促进了低温条件下蔗糖，果糖及葡萄糖的积累，对酿酒葡萄赤霞珠幼苗的抗寒性具有一定调控作用。本研究还发现，无外源激素处理的赤霞珠植株在低温恢复条件下，淀粉，蔗糖，葡萄糖和果糖含量均高于低温条件，说明低温恢复过程中光合作用增强，促进糖分的积累及淀粉的合成。

3.2 外源ABA和CaCl2对低温及低温恢复下赤霞珠幼苗蔗糖代谢关键酶活性的影响

研究表明，短期夜间低温会使番茄体内果糖和葡萄糖含量升高，酸性转化酶和中性转化酶的活性降低，蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶的活性增加，增加番茄果实内蔗糖的积累[26-27]。此外，高羊茅植株经过低温锻炼后，蔗糖含量急剧上升，茎基的蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶的活性则成倍提高[28]。而外源ABA和Ca2+也促进低温条件下植株体内酶活性的变化，研究表明高浓度的ABA能够提高瓜尔豆种子中酸性转化酶，中性转化酶，蔗糖合成酶，蔗糖磷酸合成酶的活性[29]。向体外培养1 d的玉米小苗的培养基中加入ABA后发现，1 h后根中液泡转化酶活性增强，4 h后达到最高；2 h后在叶片中增强，8 h后达到最高。在拟南芥中，外源ABA促进了肌醇半乳糖苷酶l和2基因的表达[30]。在玉米中，外源ABA促进了蔗糖磷酸合成酶活性的提高[31]。外源Ca2+能够明显提高葡萄幼苗在低温锻炼期间茎和根中SOD及POD活性，降低MDA含量，减轻质膜的膜脂过氧化程度，提高幼苗抗寒性[32-33]。目前有关外源Ca2+对低温下蔗糖代谢关键酶活性影响的研究鲜少报道。本研究发现，随着外源ABA和CaCl2浓度的逐渐升高，赤霞珠幼苗植株酸性转化酶，碱性转化酶，蔗糖磷酸合成酶及蔗糖合成酶活性的变化趋势一致，均表现出随着ABA浓度的增加，蔗糖代谢相关酶活性有逐渐升高的趋势，同时在5 mg·L-1ABA和15 mmol·L-1CaCl2处理下4种蔗糖代谢关键酶活性显著提高，但ABA作用显著高于CaCl2。且在5 mg·L-1ABA处理下4种蔗糖代谢相关酶较1 mg·L-1ABA时活性增加顺序为：SPS>SS>NI>AI。而本研究表明ABA促进了各种糖含量的积累，说明外源ABA通过提高4种蔗糖代谢相关酶活性来促进糖的积累方面起作用，也说明外源ABA促进蔗糖积累的同时也促进了蔗糖的分解，但积累大于分解。而蔗糖代谢相关酶活性的提高促进了糖的积累，减少低温对葡萄幼苗的伤害。综上，外源ABA和Ca2+在低温信号传导和增强植物抵抗低温方面发挥了积极的作用，适当施加外源ABA和Ca2+可以在一定程度上提高酿酒葡萄的抗冷性，研究结果也为后续探讨酿酒葡萄Ca2+诱导抗寒性信号产生，信号转导途径等调控机理奠定研究基础。

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Effects of exogenous ABA and Ca2+on sucrose metabolism in grape (VitisviniferaL.) seedlings under low temperature treatment and recovery

JIANG Han-yu1, WANG Wang-tian1, LEI Tian-xiang2, HE Bai-jun3, ZHANG Jin-lin4

(1.CollegeofLifeScienceandTechnology,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou,Gansu730070,China; 2.NorthwestPlateauInstituteofBiology,ChineseAcademyofScience,Xining,Qinghai810008,China; 3.GansuZixuanWineCo.,Ltd.,Jiayuguan,Gansu735100,China; 4.CollegeofPastoralAgricultureScienceandTechnology,LanzhouUniversity,Lanzhou,Gansu730020,China)

In order to figure out the responsing mechanisms of exogenous abscisic acid (ABA) and Ca2+on sucrose metabolism and key enzymes under low temperature, we measured the contents of sucrose, glucose, fructose and starch, the activities of sucrose-phosphate synthase (SPS), sucrose synthase (SS), acid invertase (AI) and neutral invertase (NI) in Cabernets (VitisviniferaL.) leaves at 5℃ and recovery at 25℃ treatment. The results showed with the increase in concentrations of ABA or Ca2+, the contents of sucrose, glucose, fructose and starch were increased significantly, and they were at the maximums when the concentrations of ABA or Ca2+were 5 mg·L-1or 15 mmol·L-1, resulting in increases of 67.88%, 21.8%, 213.77%, 7.04%, 51.38%, 2.35%, 8.84%, and 31.81%, or 72.81%, 35.37%, 123.57%, 36.44%, 25.90%, 28.67%, 210.56%, and 210.90%, respectively; The activities of acid invertase (AI), neutral invertase (NI), sucrose-phosphate synthase (SPS) and sucrose synthase (SS) were also increased markedly by 64.10%, 125.00%, 193.29%, 756.31%, 2 291.51%, 1 569.31%, 1 523.13%, and 1 336.77%, or 26.42%, 20.38%, 30.75%, 58.30%, 111.63%, 14.14%, 14.32%, and 66.39%, respectively. Our results provided evidence that exogenous ABA or Ca2+may impose damages to grape seedlings caused by low temperature. Key components of the response are: enhanced the activities of AI, NI, SS and SPS, increased soluble sugar level in leaves, promoting cold resistance ability for seedling.

VitisviniferaL.; ABA; Ca2+; Low temperature; Sucrose metabolism

1000-7601(2017)02-0127-07

10.7606/j.issn.1000-7601.2017.02.20

2015-09-27基金项目：国家自然基金(31560552)；甘肃省农业生物技术研究及应用开发项目(GNSW-2014-12，GNSW-2010-16)；甘肃省自然基金项目(506RJZA011)

姜寒玉(1980—)，女，博士，讲师，主要从事作物逆境分子生物学研究。 E-mail:jianghy@gsau.edu.cn。

共同第一作者：王旺田(1975—)，男，博士，副教授，主要从事作物逆境分子生物学研究。 E-mail: wangw@gsau.edu.cn。

S601

A