Snail、N-Cadherin、MMP-9在转移性脊柱肿瘤中的表达及其相关性研究

刘宝军 裴 斐 李继华 吴艳丽 王 静 崔永鹏

Snail、N-Cadherin、MMP-9在转移性脊柱肿瘤中的表达及其相关性研究

刘宝军 裴 斐 李继华 吴艳丽 王 静 崔永鹏

目的 研究Snail、N-Cadherin、MMP-9在转移性脊柱肿瘤中的表达及其相关性。方法 选取转移性脊柱肿瘤标本70例为研究组，患者术前均未行放化疗或生物治疗。另选取70例正常组织(脊柱肿瘤病灶旁正常组织)标本为正常组。采用S-P免疫组织化学染色方法，对标本中Snail、N-Cadherin、MMP-9表达进行检测，并分析其相关性。结果 Snail、N-Cadherin、MMP-9阳性表达率研究组依次为75.71%、70.00%、90.00%。Snail表达与N-Cadherin及MMP-9表达呈正相关；N-Cadherin表达与MMP-9表达呈正相关。结论 Snail、N-Cadherin、MMP-9表达水平在转移性脊柱肿瘤中均升高，呈正相关性，与转移性脊柱肿瘤密切相关，可为临床治疗提供参考。

Snail；N-Cadherin；MMP-9；转移性脊柱肿瘤；阳性表达率

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:731～734)

脊柱肿瘤是指主要多发于脊柱骨骼部位，其附属组织存在转移性或原发性肿瘤及瘤样病变，脊柱肿瘤发病率为全身骨肿瘤发病率的5%，转移性脊柱肿瘤占全身骨转移肿瘤比例50%左右[1]。因转移性脊柱肿瘤临床解剖位置相对较特殊，肿瘤的生长具有侵袭性会对椎体、椎旁组织、附件等直接造成破坏，脊柱稳定性丧失多累及神经根、骨髓等主要结构，严重时将导致患者出现神经功能障碍、瘫痪甚至死亡，对患者生存质量及生命安全造成威胁[2]。近年来临床相关研究表示[3]，Snail、N-Cadherin、MMP-9可能与转移性脊柱肿瘤进展及转移存在一定关联，均可为临床转移性脊柱肿瘤防治提供新思路新方法。本研究主要对Snail、N-Cadherin及MMP-9的表达情况进行检测，对3者相关性进行分析，旨在为临床治疗转移性脊柱肿瘤提供有参考价值的分子生物学指标，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般材料

选取我院2010年9月至2015年6月转移性脊柱肿瘤标本70例为研究组，另选70例脊柱肿瘤病灶旁正常组织标本为对照组，本研究所选转移性脊柱肿瘤原发病均为胃癌，分别对患者临床资料及病理分型分期、侵袭转移情况进行分析。

1.2 主要试剂与仪器

本研究所用鼠抗人N-Cadherin单克隆抗体、兔抗人Snail单克隆抗体、兔抗人MMP-9单克隆抗体、DAB显色剂及柠檬酸盐缓冲粉剂，均选购于北京中杉金桥生物科技有限公司。中性树胶由北京中山生物科技有限公司提供。包埋模具及防脱玻片选自武汉博士德生物制品有限公司。脱色摇床TS-2000A由海门市其林贝尔仪器有限公司提供，OLYMPUS BX51正置荧光显微镜选购于日本OLYMPUS公司。

1.3 方法

1.3.1 HE染色 使用二甲苯常规脱蜡，切片借助梯度酒精清洗至水化；将切片采用苏木精染色，浸泡时间为10～15 min，之后水洗；采用1%盐酸酒精进行分化，时间为2～5 s，水洗及饱和碳酸锂蓝化数秒，之后借助流水进行冲洗，水洗时间控制在15～30 min；借助1%醇溶性伊红浸染，时间5～15 s，后行常规脱水、透明并封片。

1.3.2 免疫组化方法 采用SP免疫组化染色方法进行实验：①切片置于60 ℃条件下2 h，借助二甲苯脱蜡并使用酒精梯度水化；②抗原修复；③切片上均滴一滴3%过氧化氢溶液，室内孵育10 min，PBS冲洗，每次5 min，共3次；④切片滴加动物血清(非免疫性)防治温室进行孵育，时间10 min，无需冲洗；⑤滴加一抗室温孵育1 h，PBS冲洗同时；⑥滴加二抗室温孵育10 min，PBS冲洗；⑦滴加链霉素-生物素-过氧化酶，室温孵育10 min，PBS冲洗；⑧滴加DAB溶液显色，控制显色时间，借助显微镜随时观察；⑨水冲洗后实施复染并使用中性树胶封固，借助显微镜观察；⑩以PBS溶液为一抗进行阴性对照，正常组组织为阳性对照。

1.4 结果观察及判定方法

每个切片均随机选取高倍视野(400倍)5个，各视野分别观察100个细胞，计算其中阳性细胞平均数，即为待测蛋白阳性细胞平均表达率。

Snail阳性表达为细胞核呈棕黄色；MMP-9以胞质、胞膜呈棕黄色或黄色为阳性表达；N-Cadherin表达以细胞质近细胞膜部位、细胞膜棕黄色判定为阳性细胞；根据染色深浅计分，无染色为0分、弱染色为1分，强染色为2分。根据阳性细胞表达率进行评估，1%～25%为阴性，26%～100%为阳性。

1.5 统计学方法

应用SPSS 20.0统计学分析软件进行数据处理，Snail、N-Cadherin、MMP-9在两组所得数据等计数资料均用率(%)描述，采用χ2进行检验；借助Spear man分析组间相关性；组间两两进行对比，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Snail、N-Cadherin、MMP-9在正常及转移性脊柱肿瘤组织中的表达

细胞核或胞质出现棕黄色为Snail免疫组化阳性表达。Snail阳性表达率，研究组高于正常组(P<0.05)，见表1。

表1 两组组织中Snail表达情况/例

细胞膜及细胞质近细胞膜部位出现棕黄色为N-Cadherin免疫组化阳性表达。研究组N-Cadherin表达率明显高于正常组(P<0.05)，见表2。

表2 两组组织中N-Cadherin表达情况/例

以胞质、胞膜呈黄色或棕黄色为MMP-9阳性表达。两组MMP-9阳性表达率相比，研究组高于正常组(P<0.05)，见表3。

表3 两组组织中MMP-9表达情况/例

2.2 转移性脊柱肿瘤中Snail、N-Cadherin、MMP-9表达相关性

70例转移性脊柱肿瘤标本中，N-Cadherin阳性表达49例，其中43例与Snail共同表达为阳性，比率为87.76%。Snail表达与N-Cadherin表达呈正相关，γ=0.732，见表4。

70例转移性脊柱肿瘤标本中，MMP-9阳性表达共63例，其中49例与Snail共同表达为阳性，比率为77.78%。Snail表达与MMP-9表达呈正相关，γ=0.674，见表5。

表4 转移性脊柱肿瘤中Snail、N-Cadherin表达的关系/例

表5 转移性脊柱肿瘤中Snail、MMP-9表达的关系/例

70例转移性脊柱肿瘤标本中，MMP-9阳性表达共63例，其中46例与N-Cadherin共同表达为阳性，比率为73.02%。N-Cadherin表达与MMP-9表达呈正相关，γ=0.657，见表6。

表6 转移性脊柱肿瘤中N-Cadherin、MMP-9表达的关系/例

3 讨论

转移性脊柱肿瘤可直接对患者脊椎骨质造成侵袭，破坏脊柱生物力学稳定性，具有极大危害性，该病症致残率及致死率均较高[4]。相关研究表明[5]，胃癌引发转移性脊柱肿瘤患者术后肿瘤转移、复发的风险较高，会为患者造成极大痛苦，且二次手术治疗难度大[6]。相关研究认为[7]，对转移性脊柱肿瘤患者Snail、N-Cadherin、MMP-9表达进行检测分析，可为临床疾病诊疗提供新的依据。

Snail蛋白是Snail家族中被发现的第一个蛋白，其抑制活性主要由氨基端区域结构与指结构决定，Snail蛋白表达升高会对肿瘤细胞转移及侵袭起进一步促进作用[8]。国外学者实验结果证实[9]，Snail蛋白表达作用在淋巴结状况及乳腺癌组织分级中关系密切。目前越老越多研究结果显示[10]，Snail蛋白表达强度可展示出肿瘤侵袭能力。本研究结果显示，Snail免疫组化阳性表达为胞浆、细胞核显示棕黄色，研究组Snail阳性表达高于正常组差异显著。

N-Cadherin多见于神经中、外胚层组织中[11]。相关前列腺癌、乳腺癌研究[12]认为，N-Cadherin蛋白表达反常会加快肿瘤浸润及转移，可使癌细胞转化为浸润性恶性表型，其作用较直接切明显，提示N-Cadherin蛋白与肿瘤转移及侵袭密切相关，会对肿瘤患者预后造成直接影响。本研究结果显示，研究组N-Cadherin表达高于正常组，表明转移性脊柱肿瘤中N-Cadherin阳性表明较多。

MMP-9基因约长4.5kb，位于人体染色体20q12.1-q13.1部位，在金属蛋白酶家族中加重中所占分子最大，其作用底物较多包括：多类型胶原、纤维粘连蛋白、弹性蛋白等[13]。MMP-9蛋白主要因巨噬细胞、毛细血管内皮细胞、中性粒细胞等间质细胞及恶性肿瘤细胞酶原形式分泌产物，主要功能为破坏细胞基底膜稳定；对细胞外基质Ⅳ、Ⅴ型胶原进行降解；协助肿瘤细胞浸润；促进形成新生血管及毛细血管内皮细胞再生，对肿瘤生长起扩展作用[14]。相关研究表明[15]，MMP-9蛋白表达与多类型癌症侵袭、生长及转移成正相关。与本研究结果相似，研究组MMP-9阳性表达高于正常组，表明MMP-9表达与转移性脊柱肿瘤有关。

本研究结果显示，70例转移性脊柱肿瘤标本中，Snail阳性表达53例，N-Cadherin阳性表达49例，MMP-9阳性表达63例。研究组Snail、N-Cadherin、MMP-9阳性表达均高于正常组。表明，Snail、N-Cadherin、MMP-9表达与转移性脊柱肿瘤进展存在一定关联。43例(87.76%)Snail与N-Cadherin共同表达为阳性，两者阳性表达呈正相关联。63例(77.78%)MMP-9与Snail共同表达为阳性，呈正相关联。可证实，Snail表达轻度可对肿瘤侵袭能力进行判断，其表达程度高低可作为临床判断转移性脊柱肿瘤预后预测的标志物，并提示转移性脊柱肿瘤对N-Cadherin表达的敏感性相对较高。MMP-9与N-Cadherin共同表达为阳性例数为46例(73.02%)，呈正相关联。可表明MMP-9表达程度越高对肿瘤生长促进作用越大，Snail、N-Cadherin、MMP-9 3者间关系均呈正相关联，存在互相推动增强的作用，可作为临床诊疗转移性脊柱肿瘤的分子生物学指标。

综上所述，Snail、N-Cadherin、MMP-9表达与转移性脊柱肿瘤关系密切，可作为评价肿瘤情况的指标，但本研究不排除因操作者主观意识造成的阳性细胞统计数据误差，可能对研究结果造成影响。

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(编辑：吴小红)

Research on Expressions and Correlations of Snail,N-Cadherin and MMP-9 in Metastatic Spinal Tumors

LIUBaojun,PEIFei,LIJihua,etal.

KailuanGeneralHospital,Tangshan,063000

Objective To study the expression and correlation of Snail,N-cadherin and MMP-9 in metastatic spinal tumors.Methods 70 cases of metastatic spondyloma were selected as the study group.No patients were treated with chemotherapy or biotherapy before operation.Another 70 cases of normal tissue (normal tumor tissue adjacent to the tumor) specimens were the normal group.The expression of Snail,N-cadherin and MMP-9 in the samples were detected by S-P immunohistochemical staining,and the correlation was analyzed.Results The positive expression rates of Snail,N-Cadherin and MMP-9 were 75.71%,70.00% and 90.00% respectively.Snail expression was positively correlated with N-cadherin and MMP-9 expression;N-cadherin expression was positively correlated with MMP-9 expression.Conclusion The expression of Snail,N-Cadherin and MMP-9 is up-regulated in metastatic spondyloma,which is closely related to metastatic spine tumor and can provide reference for clinical treatment.

Snail;N-Cadherin;MMP-9;Metastatic spinal tumors;Positive-expression rate

063000 开滦总医院(刘宝军，裴 斐，李继华，王 静，崔永鹏)；063000 河北省唐山市路北区疾控中心(吴艳丽)

吴艳丽

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.05.011

R738.1

A

1001-5930(2017)05-0731-04

2016-07-06

2017-03-28)