逍遥丸对调节雄激素致排卵障碍模型大鼠卵巢氧化损伤和颗粒细胞凋亡的研究

郝明 周楠 杜惠兰

·论著·

逍遥丸对调节雄激素致排卵障碍模型大鼠卵巢氧化损伤和颗粒细胞凋亡的研究

郝明 周楠 杜惠兰

目的 观察逍遥丸对雄激素致排卵障碍模型大鼠卵巢氧化损伤和颗粒细胞凋亡的影响。方法 60只9日龄SD雌性大鼠随机选取20只为正常组，余40只皮下注射丙酸睾丸酮建立雄激素致排卵障碍模型大鼠模型，造模成功后，随机分为模型组和逍遥丸治疗组，每组20只，给药5周，于动情前期断头取血，比色法测定3组大鼠血清和卵巢T-AOC水平，硫代巴比妥法测定3组大鼠血清和卵巢MDA水平；免疫组化SP法检测3组大鼠卵巢组织中Caspase-3蛋白的表达。结果 与正常组比较，模型组大鼠血清和卵巢中T-AOC水平显著降低，MDA水平显著升高(P<0.05)，模型组卵巢颗粒细胞Caspase-3蛋白表达明显高于正常组(P<0.01)。与模型组比较，逍遥丸治疗组大鼠血清和卵巢中T-AOC水平升高，MDA水平降低(P<0.05)，逍遥丸治疗组大鼠卵巢颗粒细胞Caspase-3蛋白表达值显著低于模型组(P<0.05)。结论 逍遥丸能够改善排卵障碍疾病。

逍遥丸；雄激素；大鼠；卵巢

临床中多囊卵巢综合征、功血、闭经、不孕症等属于无排卵或排卵障碍性疾病，主要是由于下丘脑-垂体-卵巢轴(HPOA)功能性或器质性病变所导致。中医认为，女子以血为本，经、孕、产、乳数伤于血。而肝主藏血，司血海，主疏泄。若肝血不足，肝失疏泄，则冲任失调为患，可导致月经紊乱、不孕等。因此，临床上运用疏肝法治疗排卵障碍性疾病疗效显著，逍遥丸具有疏肝理气、养血调经之功效，而成为疏肝法的代表药物。研究表明排卵障碍的发生可能与卵巢的氧化损伤、细胞的凋亡可有关[1]。氧自由基(OFR)能破坏氧化与抗氧化平衡，自由基造成生物体系损伤的重要因素是产生脂质过氧化物，其中最主要的是丙二醛(malondialdehyde,MDA)[2-4]。总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)的作用主要是维持内环境活性氧的动态平衡，提高机体抗自由基能力、减少脂质过氧化，使机体处于氧化还原相对稳定的状态，保护和改善细胞膜的完整性和流动性，起到调节组织细胞功能的作用。排卵障碍多表现为卵泡在排卵前的闭锁，而卵泡闭锁与卵巢卵泡细胞和颗粒细胞的凋亡有关[5]。逍遥丸促排卵的作用是否跟调节卵巢氧化损伤和颗粒细胞凋亡有关，值得我们研究。本实验以雄激素致排卵障碍模型大鼠为研究对象，探讨逍遥丸治疗雄激素致排卵障碍性疾病的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用同批出生9日龄健康雌性SD大鼠60只，体重约15 g，合格证号：812037，由河北医科大学实验动物中心提供。

1.2 实验药物 丙酸睾丸酮注射，天津金耀氨基酸有限公司生产，合格证号：0203232。逍遥丸，广西梧州三鹤药业有限公司，将200丸(每8丸相当于生药3 g)逍遥丸溶于125 ml蒸馏水中制成混悬液，置于4℃冰箱中保存备用。

1.3 主要试剂及仪器 总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；Caspase-3免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司。以上试剂盒不与其他细胞因子有交叉反应。高速冷冻离心机：DL-5 000 B，上海安亭科学仪器厂；电热恒温培养箱：HHB11360，天津三水科学仪器有限公司；OLYMPUS显微照相机：C-35AD-2，日本；721分光光度计：上海第三分析仪器厂产品。

1.4 方法

1.4.1 动物模型及分组:参照俞瑾等[6]方法，将9日龄同批出生SD雌性大鼠60只，随机选取40只于颈背部皮下注射丙酸睾丸酮0.05 ml/只(1.25 mg/只)，第70日龄时行阴道脱落细胞涂片，当阴道上皮细胞持续角化时提示造模成功。其余20只，于颈背部皮下一次性注射中性茶油0.05 ml作为正常组。40只造模成功的大鼠，随机分为模型组和逍遥丸治疗组，每组20只。遥丸治疗组:每日灌服逍遥丸5 ml(5.3 g/ml/100 g体重，相当于临床剂量20倍)，正常组和模型组灌服等剂量蒸馏水，每天1次，连续灌胃5周。

1.4.2 动物一般状况:每周测量大鼠体重，观察3组大鼠一般情况，包括形体、发育、活动、神态、摄食量、毛色等并做记录，处死前称重。

1.4.3 大鼠阴道上皮细胞检查:3组分别于给药5周后每天上午做阴道涂片1次，连续2个性周期(处死前2 d，每隔2 h涂片1次以确定动情周期)，以5%的碱性美蓝溶液染色10 min，自来水轻轻洗去多余的染色液，待干，用普通光学显微镜观察。

1.4.4 3组大鼠血清中MDA、T-AOC的检测:最后一次给药后禁食8 h，选择动情前期，断头法取血，制备血清。应用硫代巴比妥法测定3组大鼠血清MDA水平，取3组大鼠血清，按照说明要求分别加入试剂后95°沸水浴40 min，取出后流水冷却，4 000 r/min离心10 min 后取上清，532 nm处，1 cm光径，蒸馏水调零，测各组吸光度值，血清中MDA含量(nmol/ml)=(测定OD值-对照OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准品浓度(10 nmol/ml)×标本稀释前稀释倍数。应用比色法测定3组大鼠血清T-AOC水平，3组大鼠血清按说明加入试剂后，于旋涡混匀器充分混匀放置10 min，蒸馏水调零，1 cm光径，520 nm测出3组吸光度，血清中T-AOC含量(单位/毫升血清)=(测定OD值-对照OD值)/0.01/30×反应液总体积(ml)/取样量(ml)×标本稀释前稀释倍数。

1.4.5 3组大鼠卵巢组织中MDA、T-AOC的检测:将3组大鼠卵巢于冰盘上剪碎，取剪碎组织1 g研磨至匀浆，4 000 r/min离心10 min后取上清液。应用硫代巴比妥法测定各组大鼠卵巢MDA水平，方法同前，卵巢组织中MDA(nmol/mg)=(测定OD值-对照OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准品浓度(10 nmol/ml)/待测样本蛋白浓度(mg/ml)。应用比色法测定3组大鼠卵巢中T-AOC水平，双蒸水调零，1 cm光径，520 nm测出3组吸光度，卵巢组织中T-AOC含量(单位/毫克蛋白)=(测定OD值-对照OD值)/(0.01×30)×反应液总体积(ml)/取样量(ml)×标本测试前稀释倍数/待测样本蛋白浓度(mg/ml)。

1.4.6 3组大鼠卵巢组织中Caspase-3蛋白表达的检测:在冰盘上取下卵巢，分别置于4%多聚甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋，切片，采用免疫组化SP法分析卵巢Caspase-3蛋白的表达，以PBS代替一抗作为阴性对照，以试剂公司提供的阳性对照切片作为阳性对照；染色判定：细胞膜上和胞质中均出现棕黄色颗粒者为阳性细胞，而且结构清晰，着色明显高于背景，显色强度与背景无差别者或不着色为阴性表达。结果判读：每张切片在200倍镜下观察全片，随机选择5个视野，每个视野计数200个细胞，计算阳性细胞所占的百分数，分级如下：>50%为强阳性(+++)，25%～50%为阳性(++)，<25%为弱阳性(+)，无着色为阴性(-)，并采用Motic Images Advanced 6.0图像分析系统测定灰度值，灰度值越低，蛋白表达含量越高

2 结果

2.1 动物一般状况 实验过程中，正常组和逍遥丸治疗组大鼠均发育良好，毛色白而光泽，精神佳，活泼，反应灵敏，饮食、大小便正常。模型组大鼠精神欠佳，反应较迟钝，体重增加。

2.2 阴道上皮细胞涂片 连续给药5周后，正常组阴道细胞呈典型的周期性变化，即动情前期、动情期、动情后期、动情间期；雄激素模型组阴道上皮细胞呈持续角化，逍遥丸治疗组大部分大鼠阴道上皮细胞呈周期性变化。

2.3 3组大鼠血清中T-AOC、MDA水平比较 与正常组相比，逍遥丸治疗组大鼠血清T-AOC、MDA水平恢复正常(P>0.05)，模型组大鼠血清T-AOC水平降低，血清MDA水平升高(P<0.05)；与模型组大鼠相比，逍遥丸治疗组大鼠血清T-AOC水平升高，血清MDA水平降低(P<0.05)。见表1。

组别T⁃AOC(U/ml)MDA(nmol/ml)正常组4．67±1．221．87±0．46模型组3．15±0．34∗2．57±0．75∗逍遥丸治疗组4．05±0．69#2．04±0．31#

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

2.4 3组大鼠卵巢中T-AOC、MDA水平比较 与正常组相比，逍遥丸治疗组大鼠卵巢中T-AOC降低、MDA水平升高，但差异均无统计学意义(P>0.05)，模型组大鼠卵巢中T-AOC水平显著降低，血清MDA水平显著升高(P均<0.05)；与模型组大鼠相比，逍遥丸治疗组大鼠血清T-AOC水平升高，血清MDA水平降低(P<0.05)。见表2。

2.5 3组大鼠卵巢颗粒细胞Caspase-3蛋白的表达与正常组比较，逍遥丸治疗组大鼠卵巢颗粒细胞Caspase-3蛋白表达高于正常组，但差异无统计学意义(P>0.05)，模型组卵巢颗粒细胞Caspase-3蛋白表达明显高于正常组(P<0.05)；与模型组比较，逍遥丸治疗组大鼠卵巢颗粒细胞Caspase-3蛋白表达值显著低于模型组(P<0.05)。免疫组化结果表明，Caspase-3蛋白的表达主要位于细胞膜上和胞质中，呈棕黄色颗粒。Caspase-3蛋白在正常组染色较浅且颗粒细胞较多，只有少数呈粒状着色，灰度值较高；在模型大鼠卵巢颗粒细胞上可以见到大部分色呈片状或颗粒状的Caspase-3蛋白，染色较深，提示模型组Caspase-3蛋白表达较强，灰度值较低；遥丸治疗组大鼠卵巢颗粒细胞不同程度变稀疏，体积稍增大，细胞胞浆内片状和颗粒状的Caspase-3染色颗粒较模型组减少，颜色变浅。见表3，图1。

组别T⁃AOC(U/ml)MDA(nmol/ml)正常组3．50±0．631．97±0．59模型组2．48±0．36∗3．04±0．92∗逍遥丸治疗组2．92±0．42#2．48±0．64#

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

组别Caspase⁃3正常组150．7±6．8模型组111．6±9．5∗逍遥丸治疗组138．9±11．3#

注：与正常组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.05

模型组逍遥丸治疗组正常组

图1 4组大鼠卵巢颗粒细胞Caspase-3蛋白的表达(SP法×40)

3 讨论

中医诸多先贤论述，强调了肝在女性生殖功能方面的重要作用。如《景岳全书·妇人规》：“产育由于血气，血气由于情怀，情怀不畅则冲任不充，冲任不充则胎孕不受。”《妇人大全良方》曰：“……感愤而不得言，多有闭经之虞。”《四圣心源》：“木气之疏泄，崩漏之机也。”《济阴纲目》：“情不宣畅，经多不调，故难孕。”在《素问病机气宜保命集·妇人胎产论》“妇人……天癸既行，皆从厥阴论之”，指出在生育年龄阶段患病，多从肝调治。因此，临床上运用疏肝法治疗月经紊乱、不孕症者比比皆是，而且疗效显著[7-10]。所以，我们认为肝主疏泄，调畅气机，是冲任二脉阴阳消长转化、卵子发育成熟并能顺利排出的枢机。本实验确定以疏肝解郁作为排卵障碍性疾病的治疗大法，逍遥丸是经典的调经方药并在千百年来广泛应用于月经病和不孕症等无排卵疾病，并且有较好的疗效。逍遥丸是在宋朝《太平惠民和剂局方》“逍遥散”的基础上应用现代生产工艺技术所制成的新型中药制剂，此方由柴胡、茯苓、白术、当归、甘草等组成。本方原治肝郁脾虚血虚之证，为疏肝解郁、健脾养血、调和肝脾之常用方，因本方有疏肝解郁、养血活血之功，故选用逍遥丸作为疏肝解郁的代表方进行实验研究。

目前，关于排卵障碍的发生机制方面尚有许多不明之处。因此研究排卵障碍发生的机制，促进卵泡发育，诱发排卵，长期以来一直是妇科领域十分关注的课题，卵巢的氧化损伤和颗粒细胞凋亡可能与排卵障碍的发生有关[11,12]。目前越来越多的证据表明氧自由基(OFR)参与了细胞凋亡的发生。OFR能破坏氧化与抗氧化平衡，且在细胞凋亡中起重要作用[13]。已知机体内氧自由基能引发生物膜中脂质过氧化作用,形成脂质过氧化物，如MDA、酮基等，导致细胞代谢、功能和结构的改变。自由基过度产生和消除能力下降是引起生物体病理性变化的不可忽视的因素。MDA具有很强的生物毒性，极易与磷脂蛋白发生反应，改变细胞膜的通透性，而造成组织细胞的氧化损伤，体内MDA的含量间接地反映细胞损伤的程度。T-AOC的作用主要是维持内环境活性氧的动态平衡，分解过高的自由基和活性氧，提高机体抗自由基能力、减少脂质过氧化，使机体处于氧化还原相对稳定的状态，保护和改善细胞膜的完整性和流动性，起到调节组织细胞功能的作用。本实验结果显示，雄激素致无排卵模型大鼠的血浆和卵巢MDA含量明显高于正常大鼠，血浆和卵巢的T-AOC含量明显低于正常组，而经过逍遥丸治疗的大鼠其血浆和卵巢的MDA含量降低，血清和卵巢的T-AOC和胆红素水平提高，推测氧化损伤、总抗氧化能力损伤可能是导致排卵障碍的重要因素之一。逍遥丸可能是通过提高HO-1活性，增加其代谢产物-胆红素水平，进而提高T-AOC的能力，从而减少卵巢组织的氧化损伤，促进卵泡的发育成熟。

研究表明，当幼龄雌性鼠给予外源性雄激素后，导致HPOA改变，使血清中黄体生成素(LH)/卵泡刺激素(FSH)在周期中比值升高，不能形成LH峰，故不能出现排卵，并且T升高时,可直接作用于卵子,或影响内膜的发育导致卵泡发育停滞闭锁，引起排卵障碍[14,15]。另外，卵巢微环境由于雄激素的增加，损害卵母细胞和颗粒细胞，导致卵泡闭锁。排卵障碍多表现为卵泡在排卵前的闭锁，而卵泡闭锁与卵巢卵泡细胞和颗粒细胞的凋亡有关。凋亡蛋白质酶是一类半胱氨酸蛋白质酶，具有特异性水解底物分子天冬氨酸(Asp)残七C端肽键功能，是近年随着凋亡研究的深入而发现的重要凋亡分子，在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用[16]。迄今已有13个分子得到命名，分别为凋亡蛋白质酶1～13。其中凋亡蛋白质-3(Caspase-3)是被认为在多种组织、细胞类型中最常涉及的凋亡效应分子。它在凋亡信号转导的许多途径中发挥着重要的作用。Caspase-3正常以酶原的形式存在于细胞浆内，在凋亡的早期阶段被激活，活化的Caspase-3引起一系列级联反应，最终引起细胞凋亡。因此，检测Caspase-3的活性有助于发现早期的凋亡细胞。本实验结果表明，逍遥丸可以不同程度上减少激素致无排卵模型大鼠卵巢中颗粒细胞Caspase-3蛋白的表达，从而减少颗粒细胞的凋亡。我们推测，一方面逍遥丸可能是通过激活下丘脑、垂体负反馈机制，促进E2、FSH的分泌，降低T、LH的分泌，从而调节性激素水平，调整模型大鼠卵巢组织中异常增高的Caspase-3蛋白的表达，减少颗粒细胞的凋亡，增强垂体及卵巢的反映性，改善性腺轴的功能，从而部分恢复卵巢的功能。另一方面逍遥丸的类激素作用直接作用于卵巢，调节卵巢组织Caspase-3蛋白水平及颗粒细胞的凋亡，提高卵巢对垂体分泌的性腺激素的反应性，进而调节性腺激素的分泌，增强肾-天癸-胞宫之间的功能。

综上所述，逍遥丸重在疏肝理气，通过改善排卵障碍模型大鼠卵巢的氧化损伤和卵巢颗粒细胞的凋亡，从而促进卵泡的发育、成熟及促进排卵，肯定了逍遥丸在治疗排卵障碍疾病的疗效。

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Study of effects of Xiaoyao pill on ovarian oxidative damage and apoptosis of granulosa cells in androgen-induced sterile rats

HAOMing*,ZHOUNan,DUHuilan.
*DepartmentofObstetricsandGynecology,BethuneInternationalPeaceHospitalofPLA,Shijiazhuang050082,China

Objective To observe the effects of Xiaoyao pill (XYP) on ovarian oxidative damage and apoptosis of granulosa cells in androgen-induced sterile rats (ASR).Methods Forty female SD rats (9-day age) were randomly divided into control group (n=20)andmodelgroup(n=40).Theratmodelswithovulationfailure(ASR)wereestablishedbysubcutaneousinjectionwithtestosteronepropionate,aftermodeling,the40ratswererandomlydividedintomodelcontrolgroupandXiaoyaopilltreatmentgroup(medicationfor5weeks),with20ratsineachgroup.Thentheseratsweresacrificedandbloodspecimensweretaken,thelevelsofT-AOCinserumandovariantissueweredetectedbycolorimetry,andthelevelsofMDAinserumandovariantissueweredetectedbypenthiobarbitalmethod(TBA),andtheexpressionlevelsofCaspase-3proteinweredetectedbyimmunohistochemisty.Results As compared with those in control group, the levels of T-AOC in serum and ovarian tissue in model group were significantly decreased,however,the levels of MDA were significantly increased (P<0.05).TheexpressionlevelsofCaspase-3proteininovarygranulosacellsweresignificantlyhigherthanthoseincontrolgroup(P<0.01).Ascomparedwiththoseinmodelcontrolgroup,thelevelsofT-AOCinserumandovariantissueinXiaoyaopilltreatmentgroupweresignificantlyincreased,however,thelevelsofMDAweresignificantlydecreased(P<0.05),moreover,theexpressionlevelsofCaspase-3proteinofovarygranulosacellsinXiaoyaopilltreatmentgroupweresignificantlylowerthanthoseinmodelcontrolgroup(P<0.05).Conclusion XYP can improve follicular development and ovulation failure.

Xiaoyao pill;androgen;rats;ovary

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.09.008

050082 石家庄市，中国人民解放军白求恩国际和平医院妇产科(郝明);河北省邢台市人民医院妇一科(周楠)；河北中医学院中西医结合学院(杜惠兰)

R

A

1002-7386(2017)09-1312-05

2016-10-11)