利用ISSR标记分析20份甜菜品种的遗传多样性

刘华君，聂志勇，林明，白晓山，邓超宏，潘竟海，陈友强，李承业*

试验研究

利用ISSR标记分析20份甜菜品种的遗传多样性

刘华君1，聂志勇2，林明1，白晓山1，邓超宏1，潘竟海1，陈友强1，李承业1*

（1.新疆农业科学院经济作物研究所，乌鲁木齐830091；2.新疆农业大学农学院，乌鲁木齐830052）

针对来源于德国的18份甜菜品种和来源于瑞士的2份甜菜品种进行遗传图谱的构建和聚类分析。以5份甜菜种质资源为材料，对引物UBC801～UBC900等100个引物进行筛选，筛选出多态性好的ISSR引物7个。利用7个ISSR引物扩增适宜新疆种植的20份甜菜种质资源，共获得39个等位变异，每对引物检测到的等位变异数的变幅为3～8个，平均等位变异数5.6个。其中多态性条带为30条，7对ISSR引物的多态信息含量（PIC）的变化范围为0.6273～0.8360，平均为0.7650，20份参试品种遗传相似系数的变异范围为0.4615～0.9231，平均为0.6923。供试20份甜菜品种遗传多样性丰富。ISSR分子标记技术可以有效地用于甜菜品种资源评价和指纹图谱构建。

甜菜；遗传多样性；ISSR；种质资源

甜菜（Beta vulgaris L.）属于二年生草本植物，原产于欧洲西部和南部沿海[1]，是世界两大糖料作物之一。在我国已栽培百年有余，但由于中国不是起源国，缺少种质资源，育种水平提升缓慢[2]。近年来，随着植物分子生物学的迅猛发展，使得作物分析进入了新的分子水平层次，而分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后的一种新型遗传标记[3]，目前我国对于甜菜品种的鉴别依然采用的是形态学方法[4]。此种方法不仅鉴定周期长而且准确率低。分子标记技术具有简单、共显性、条带清晰、重复性好等特点[5]，已经广泛地应用到作物品种的鉴定。目前甜菜引物已经有上千对[6]，利用该技术对新疆甜菜品种资源进行比较分析，从而可确定种质的遗传多样性，对选育优良品种提供相对准确的依据。

ISSR技术具有重复性高、程序相对简单、不需要已知序列信息的特点[7-8]，且针对重复序列含量高的物种，利用ISSR法可与RFLP、RAPD等分子标记相媲美，因此，被广泛应用于植物种质资源鉴定、遗传多样性和进化生物学等研究。分子标记技术在甜菜研究中应用得相对较晚，可对比和参考的文献较少，但已经在某些作物DNA指纹图谱[9]，重要农艺性状基因的标记定位[10]，种质资源的遗传多样性分析与品种指纹图谱[11-12]、纯度鉴定[13]等方面取得了某些成果。为了甜菜种质资源更好地开发与利用，本研究以20份新疆种植的甜菜品种为材料，利用7对ISSR引物对其进行多样性评价，研究结果可用于甜菜品种资源评价和指纹图谱构建。

1 材料与方法

1.1供试材料

从国外引进品种中选取20份，主要是由德国斯特儒博公司的17份品种以及瑞士先正达公司的2份，及德国KWS公司的1份。全部供试材料（表1）于2014年4月种植于新疆农业科学院奇台县西地镇试验田。

1.2基因组DNA的提取和纯化

取幼苗时期甜菜叶片0.20 g，液氮冷冻下研磨成粉末。基因组DNA提取采用天根试剂盒法（北京）。用核酸蛋白检测仪测定DNA浓度，将DNA样品稀释到100ng/ μL备用。

表1 供试甜菜品种来源及生物学特性Table 1 Sugarbeet accessions used in this study

图1 17个材料用ctf 2引物扩增结果Fig.1 Amplification results of primer ctf 2 in 17 Beta vulgaris resources

1.3多态性ISSR引物筛选

以编号为1～5材料的基因组DNA为模板，对引物UBC801～UBC900等100个ISSR引物（北京博迈德生物工程有限公司合成）进行多态性筛选，从中选取扩增条带清晰，条带数较多，重复性较好的7条引物（见图1）进行PCR扩增。

1.4ISSR标记扩增及电泳检测

PCR扩增总体系为15 μL，其中10×Buffer 2.5 μL，Mg2+（2.0 mmol/L）2.5 μL，dNTP（200 μmol/L）1μL，0.3 μL Taq酶（1 U北京天根生物技术有限公司），DNA（50 ng/μL）1μL，引物（0.2 μmol/L）1μL，加双蒸水至反应体系为15 μL。

PCR扩增反应在Bio-Rad PTC200 PCR仪（Bio-Rad公司）上进行，扩增程序为94℃预变性5 min，94℃变性2 min，50℃和54℃退火1 min，72℃延伸2 min，32个循环；72℃终延伸10 min；4℃保存。退火温度因扩增产物的效果而调整。PCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳分析（130 V，60 mA，北京六一仪器厂），染色，凝胶成像仪Gel Doc 2000TM（Bio-Rad，USA）观察照相并记录。

1.5甜菜DNA指纹图谱的绘制

分析20份甜菜材料清晰可见的ISSR扩增条带。对于每条ISSR引物的扩增产物，按照扩增条带的分子量从大到小编号。在相同迁移率位置上，有带记为1，无带记为0，从而将图形数据转换成数字数据存于Excel表中。将每个Excel表格中的0、1序列数据阵导入NTSYS-PC 2.10e和ntedit软件中，进行运算处理。即可得到参试品种遗传相似系数的变异范围以及从Excle中得出ISSR引物的多态性信息量（PIC）的变化范围，从而构建出供试20份甜菜种质资源的DNA指纹图谱。

表2 7对引物特征信息Table 2 Characterization of 7 polymorphic microsatellite loci in the experiment

2 结果和分析

2.1ISSR标记的多态性

选择7对多态性好的引物对20份新疆甜菜材料进行PCR扩增，共扩增出39条带，其中多态性带30条，多态性比率76.92%，每对引物等位变异数3～8个，7对引物平均多态性等位变异数5.6个，71%（5个）位点的等位变异数超过了5个。7对ISSR引物的多态性信息量（PIC）的变化范围为0.6273～0.8360（表2），平均0.7650，引物最高为UBC801，引物UBC857最小。有2对引物的多态信息含量高于0.8，占28.6%。

2.2参试品种（系）遗传相似系数

利用NTSYS-PC 2.10e遗传分析软件，根据ISSR标记数据计算出品种间的遗传相似系数（GS）（图2），从图中可以看出除7对引物可以将所有供试材料区分开，表明不同品种之间具有一定的异质性。20份参试甜菜品种遗传相似系数的变异范围为0.46153～0.92307，平均值为0.69230，其中ST13105号与ST21015间的遗传相似性最低（0.46153）。

2.3聚类分析

依各甜菜品种的遗传相似系数，用UPGMA法进行聚类分析，在相似系数为0.77处聚为六大类（图2）。

图2 甜菜不同材料的亲缘关系及遗传多祥性聚类图Fig.1 Dendrogram generated by cluster analysis for 38 sugarbeet varieties

第一大类只包含有1个品种，来源于德国斯特儒博公司的ST13012。

第二大类包含有7个品种，在0.85处可进一步划分为4组。第一组包含有3个品种分别是来自德国斯特儒博公司的ST13112、ST13109以及SD13829；第二组只包含有来自德国斯特儒博公司的ST14109；第三组包含有两个品种，分别是来自德国KWS公司的KWS7125以及来自瑞士先正达的HI0936；第四组只包含有来自德国斯特儒博公司的ST14091。

第三大类包含有两个品种，分别是德国斯特儒博公司的ST13929以及ST21015。

第四大类包含有5个品种，在0.82处可进一步分为3组。第一组包含有两个品种来自德国斯特儒博公司的SD13829、ST13092；第二组包括两个品种德国斯特儒博公司的ST13029以及ST14024；第三组只含有1个品种来自瑞士先正达的HI0466。

第五大类只包含有1个品种来自德国斯特儒博公司的ST13139。

第六大类包含有4个品种，在0.85处可进一步分为3组。第一组包含有两个品种德国斯特儒博公司的ST13039以及ST13105；第二组只包含有一个品种来自德国斯特儒博公司的ST12927；第三组只包含有德国斯特儒博公司的ST13906。

3 讨论

刘巧红等[14]针对来源于荷兰的4个引进甜菜品种和国内的6个甜菜品系（其中两个为一年生野生甜菜）进行了ISSR指纹图谱构建和聚类分析研究。利用筛选的6条引物ISSR-PCR共扩增出51个条带，其中多态性条带百分率为86.3%。遗传相似性聚类分析结果显示，10个甜菜品种（系）的相似系数为0.43～0.83，平均为0.62。Liu等[15]在2012年举行的生物医学工程与生物技术（iCBEB）国际会议上发文中指出，利用简单重复序列标记（ISSR）对来自中国和荷兰的一共13个甜菜品种进行识别和聚类分析，利用6条多态性高、稳定性好的引物进行筛选。利用ISSR-PCR与6个引物得到48条带，13个甜菜品种和品系间的多态率为87.5%，相似系数范围是0.46～0.89，平均为0.67。

本研究的7对ISSR引物共扩增出39条带，其中多态性条带30条，多态性比率为76.92%，每对引物等位变异数3～8个，7对引物平均多态性等位变异数5.6个，有71%（5个）位点的等位变异数超过了5个。7对ISSR引物的多态性信息量（PIC）的变化范围为0.3427～0.7854，平均0.5292；20份参试品种遗传相似系数的变异范围为0.46153～0.92307，平均值为0.6923。引物UBC801最高，引物UBC857最小。有两对引物的多态信息含量高于0.8，占28.6%。可以看出虽然本研究的多态率比刘巧红等人少，但遗传相似系数变化范围以及平均值均比前人的研究结果大，这可能是由于本研究无论是引物数量还是参试品种数都较前人多的原因。且本研究充分利用ISSR标记准确性高的特点，20个品种等位变异数较多，有71%超过了5个，因而具有较高的准确性。参试品种虽大部分来自同一个公司，但依然可得出本试验的参试甜菜品种的遗传多样性较高。

4 结论

本研究利用ISSR分子标记技术研究在新疆种植的20份甜菜栽培品种的遗传多样性，通过筛选得到了7对适合甜菜的引物，共扩增出39条引物，其中多态条带为30条，7对ISSR引物的多态性信息量（PIC）的变化范围为0.3427～0.7854，平均0.5292；20份参试品种遗传相似系数的变异范围为0.46153～0.92307，平均值为0.6923。供试20份甜菜品种遗传多样性丰富，ISSR分子标记技术可以有效地用于甜菜品种资源评价和指纹图谱构建。新疆甜菜栽培地区气候及地理差异较大，需要不同特性的品种以适应当地气候，且新疆不是甜菜的发源地，没有较多的种质资源用于育种研究。因而了解适宜新疆种植的甜菜种质资源的遗传多样性无论是引种还是育种都显得尤为重要。通过本研究可以看出适宜新疆种植的甜菜品种遗传多样性比较丰富，但不同育种单位之间还是应加强甜菜种质资源交流和交换以加强新疆甜菜品种的遗传多样性和品种适应性。

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Genetic Diversity Analysis of Sugarbeet Cultivars by ISSR Marker

LIU Hua-jun1，NIE Zhi-yong2，LIN Ming1，BAI Xiao-shan1，DENG Chao-hong1，PAN Jing-hai1，CHEN You-qiang1，LI Cheng-ye1*
(1.Research Institute of Industrial Crops,Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi 830091，China；2.College of Agriculture,Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830091，China)

A genetic map and cluster analysis for 18 sugarbeet varieties from Germany and 2 sugar sugarbeet cultivars from Switzerland were built.Five sugarbeet germplasms were used as material to screen 100 primers (UBC801～UBC900)and obtained 7 ISSR with high polymorphism.Seven ISSR primers were used to fulfill amplification of 20 sugarbeet germplasms,and got total of 39 allelic variation,It was detected that the amplitude for number of alleles was 3～8 from each pair of primers,the average number of alleles was 5.6.Among them the number of polymorphic bands are 30,polymorphic information content(PIC)of 7 pairs SSR primers range of variation was 0.6273～0.8360,with an average of 0.7650.The genetic similarity coefficient of 20 beet germplasms was 0.4615～0.9231,with an average of 0.6923.Conclusion：there existed abundant genetic diversity among 20 sugarbeet and their relationships were significantly correlated with countries'distribution.ISSR molecular markers could be effectively used in genetic diversity and fingerprint analysis for sugarbeet.

sugarbeet;genetic diversity;ISSR;germpoasm resources

S566.3

：A

：1007－2624（2017）03－0001－04

10.13570/j.cnki.scc.2017.03.001

2017-03-09

现代农业产业技术体系建设项目-甜菜产业技术体系玛纳斯综合试验站（CARS-210410）。

刘华君（1970-），男，副研究员，研究方向为甜菜遗传育种与栽培，E-mail：13899962328@163.com。

李承业（1955-），男，推广研究员，研究方向为甜菜栽培，E-mail：lcy7679@126.com。