一测多评法在中药质量控制中的应用及关键问题

陈杨 徐光临 徐德生 刘力



一测多评法在中药质量控制中的应用及关键问题

陈杨 徐光临 徐德生 刘力

中药多成分、多靶点的特性决定了中药质量控制模式必须是多成分定量和多指标监控，但中药对照品难以获得阻碍了该模式的应用，限制了中药现代化的发展。一测多评法是运用一种中药对照品来实现对多个待测组分进行分析的方法。本文就一测多评法的原理以及研究进展进行概述，并就其在研究过程中存在的关键问题进行讨论。

一测多评法； 中药； 质量控制

中药成分的复杂多样性决定了单一成分无法准确实现对中药的质量控制[1]，将化学药物单一活性成分的研究方式直接应用于中药，不仅完全背离了中医“方—证—效”的治疗理念，也忽视了中药多靶点、多途径的整体调节作用[2]，由此提出了中药多成分的质量控制模式。传统多指标同步质量控制需要多种中药对照品。中药对照品分离难度大、货源紧缺及价格高昂[3]，王智民等[4]提出了一种新的多成分定量方法，即“一测多评”法(quantitative analysis of multi-components by single-marker, QAMS)，该方法基于中药各成分间存在对应的函数关系，运用一种价廉易得的对照品，实现对其他多个难以获得对照品的成分的定量分析。

一测多评法相较于传统质量控制方法，具有经济、高效、简单的优势。从2006年对单味药中同一类化学成分的研究开始，到2016年出现对单味药、中药复方、中药保健品中同一类或不同类化学成分的研究论文近1000篇。早在2010年版中国药典一部[5]中，已经收录运用QAMS法测定黄连中小檗碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、药根碱等成分的含量。在2015年版中国药典一部[6]中，新增了运用QAMS法测定丹参中丹参酮Ⅱ A、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮的含量以及生姜中6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚的含量。

本文在查阅总结文献的基础上，就一测多评法在单味中药及中药复方研究过程中的进展、疑难点进行概述，并展望了其应用前景。

1 “一测多评”法基本原理

“一测多评”法借鉴内标法、校正因子法、主成分自身对照法等研究方法，依据在一定范围内检测成分的量与检测器响应成正比的原理，引入相对校正因子(relative correction factor，RCF)的概念[4]。在多指标质量评价时，以药材中相对易得的公认的有效成分为内标物，建立内标物与其他待测成分的RCF，通过RCF计算其他成分的含量。按下式计算[7]。

假设某样品中含有i个组分：

式中Ai为组分峰面积；Wi为组分浓度；fi为组分i(i=1,2，...，k，...，m)的相对校正因子。

选取其中一组分k为内标, 建立组分k与其他组分m之间的相对校正因子fkm。转换得到定量计算公式:

式中Ak为内标物峰面积，Wk为内标物浓度。Am为其他组分m峰面积，Wm为其他组分m浓度。然后进行方法学验证、方法耐用性、系统适用性研究，并且运用合理的方法评价实测值与计算值之间有没有统计学差异。

2 “一测多评”法的研究进展

自王智民等[4]提出一测多评法的概念以来，一测多评法在单味中药及中药复方制剂的质量控制研究工作中得到越来越多的应用[8]。

2.1 一测多评法在单味中药中的应用

目前运用QAMS进行研究的单味药或其炮制品已经达到六十多种，涉及的化合物类型包括：木脂素类[9]、皂苷类[10-11]、生物碱类[12-13]、多酚类[14]、香豆素类[15-16]、单萜类[17-18]、黄铜醇类[19]、萘醌类[20]、蒽醌类[21-22]。由于同一类化合物的结构相似，紫外吸收接近，因此目前大部分研究都是针对有相似母核的化合物，例如大黄蒽醌[21]、人参皂苷[11]等。也有一部分是针对母核不同的化合物，例如鱼腥草中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸属于苯丙素类化合物，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷等属于黄酮类化合物[23]。

在进行成分分析时，高效液相色谱法以其灵敏度高、分离选择性高、效率高的特点被广泛使用。张文生等[18]采用内标法和外标法同时测定白芍中5种成分的含量，实验结果表明：以芍药苷为内标物的一测多评法测得的5种成分的含量与外标法实测值相对偏差在5%以内，一测多评法可作为白芍药材的质量评价方法。王晓燕等[24]采用高效液相色谱法，以马钱苷为内标，建立酒山萸肉中5个环烯醚萜苷成分的含量测定方法，并以外标法确定了在缺乏对照品的条件下该一测多评法的可行性。

基于有效成分的不同理化性质，新技术如高效液相色谱—质谱—电雾式检测法也已被引入使用。赵鑫等[9]采用高效液相色谱—质谱—电雾式检测法测定辛夷提取物中4种木脂素成分的含量，此联用技术相较于一般单纯使用高效液相色谱仪的方法，在针对紫外吸收中吸光度较小的成分，准确度更高。其原因可能在于该法的检测信号不依赖于化学结构，具有通用性。鉴于各研究的研究方法与思路基本相同或相似，故将所涉及的研究品种、化学成分类别、内标物和待测成分归纳总结于表1。

目前发表的文献中，运用QAMS法进行不同类别化学成分的研究仍然只占中药品种的极少部分，大部分结构差异悬殊、色谱保留性质相差巨大的成分以及在单味药中含量太少的有效成分，都达不到QAMS法的应用条件。除了应用条件的限定外，待测组分色谱峰的定位、对照品纯度、检测波长的选择、色谱系统不同带来的误差都是目前QAMS法研究过程中的难点，需要进一步思考。

2.2 一测多评法在中药复方制剂中的应用

目前，QAMS法在中药制剂的质量控制研究中已经涉及到多种剂型，包括片剂、颗粒剂、丸剂、胶囊、滴丸、注射液等，其中片剂、颗粒剂较多，例如紫龙金片[28]、清清颗粒[29]、参芎养心颗粒[30]等。药物组成从一味(例如银杏叶胶囊)到十七味(例如大败毒胶囊)不等。

QAMS法在中药复方制剂中的应用与在单味药中的应用相似，选择复方中具有代表性的容易获得的有效成分作为内标物，例如银翘解毒系列制剂中选择绿原酸作为内标物[31]，香连制剂中选择小檗碱作为内标物[32]，建立起内标物与待测组分之间的RCF，将此RCF作为常数来计算待测组分的含量。任德飞等[33]采用高效液相色谱法测定苦碟子注射液中4种有机酸类成分的含量，选择菊苣酸为内标物，测定菊苣酸与咖啡酸、绿原酸、单咖啡酰基酒石酸的相对较正因子，进而计算注射液中有机酸的含量。并将测得的数值与外标法测得的实测值进行评价，验证了一测多评法的准确性。

为了更加完善地反应中药复方的内在质量，新技术如超高效液相色谱也已被引入。崔璐等[34]采用高效液相色法和超高效液相色谱法两种色谱系统，以新橙皮苷为内标物，分别测定朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、虎杖苷、淫羊藿苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷的含量。针对QAMS法研究中检测波长的选择难点，应用了全时段多波长融合技术，以更全面的对前列癃闭通片进行质量评价。结果表明：相较于高效液相色法和超高效液相色谱法具有分离效果好、灵敏度高、流动相用量少等优势，选择超高效液相色谱法可以更方便、快速地完成前列癃闭通片的含量测定。基于研究思路的相似性，故将已开展QAMS研究的中药复方的研究情况归纳总结于表2。

表1 已开展QAMS研究的单味中药

表2 已开展QAMS研究的中药复方

中药复方制剂具有多成分、多靶点的特性，采用一测多评法可以更全面、科学地控制中药质量标准，建立适合的定量分析方法。然而该方法同样有局限性，目前尚未有中药制剂中多味药材不同组分能够同时进行定量分析的研究报道，这也是目前QAMS研究中急需突破的瓶颈。

3 “一测多评”法研究过程中存在的关键问题

一测多评法是中药多组分同步监测的发展方向，也是2015年版中国药典[6]修订中重点推广的技术。目前其研究范围涉及了多种中药材及饮片、中药复方制剂、中药提取物等，但是收录于药典得到认同的仍局限于几个品种，其研究过程中存在一些疑难点及关键问题需要引起关注。

3.1 待测组分色谱峰定位方式的选择

目前对于待测组分色谱峰的定位方式大致分为两类。第一类是比较普遍的相对保留时间差值定位和相对保留值定位。相对保留时间差值定位，即在参考紫外图谱的同时，运用待测组分与内标物保留时间之差进行定位，此方法是王智民等[4]第一次提出QAMS方法时运用的定位方式，后来的学者在此基础上提出了相对保留值定位方法，即在参考紫外图谱的同时，运用待测组分与内标物的保留时间的比值进行定位。在目前发表的文献中，运用相对保留值进行定位的比重较大。

第二类是在不同色谱柱带来的误差较大的情况下，基于在相同的分析条件下，采用不同的色谱柱，组分的保留时间存在简单的线性关系的理论，运用不同色谱柱下组分对应的不同的保留时间推导出校正方程，从而得出理论出峰时间进行定位。例如在鱼腥草的质量控制研究中[23]，采用绿原酸(内标物)和最后一个容易辨认的色谱峰(槲皮苷)两点校正，分别以不同色谱柱分离的绿原酸和槲皮素的保留时间为X、Y，推导出校正方程，将待测各组分的保留时间带入，即可得到理论出峰时间，从而完成快速定位[19]。目前此方法的应用较少，需要进一步完善。

待测组分色谱峰定位方式的选择直接影响检测器响应值的准确性，也是一测多评法研究过程中一直存在的争论点，研究者可以根据自身不同的实验条件，选择一种或两种定位方法进行考察，选择相对偏差较小的方法进行实验，以保证实验的严密性。3.2 对照品纯度的标定问题

目前笔者未见国内文献报道关于自制对照品纯度的严格的标定方法，需要引起重视。QAMS法的应用中，待测组分的对照品大部分为缺乏供应或者价格昂贵的产品。此类对照品大部分需要实验室自制，再经过基于光谱数据的结构鉴定和高效液相面积归一化法的纯度检查，然而由于检测器适用范围的限制，很有可能导致纯度低于98%从而影响实验结果。Wang CQ等[10]运用三七药材中六种成分(人参皂苷R1、Rg1、Rg2、Rb1、Rd、三七皂苷R4)作为内标来研究化合物的结构、待测组分的浓度、对照品的纯度对QAMS法准确性的影响，结果显示，待测组分的浓度是主要影响QAMS法准确性的因素，其他因素对准确性的影响很小。

针对此疑难点，笔者考虑可以采用两种以上不同分离机理或者不同色谱条件进行验证比较，同时尽量减少外界因素(实验室、操作人员、仪器等)的干扰，去除离群值后进行可信限的计算。

3.3 检测波长的选择方式

目前QAMS法最常用的检测器是紫外检测器，大部分常见的有机物和部分无机物都具有紫外吸收，然而单一波长不能全面、客观地反映药材或制剂的内在质量，针对不同结构的化合物，检测波长的选择方式也是不同的。

针对具有相同母核的化合物，为了得到高灵敏度，一般选择待测物具有最大吸收峰处作为检测波长，例如玳玳果黄酮滴丸中四种黄酮类成分柚皮苷、 新橙皮苷、 橙皮内酯水合物、枳属苷，选取最大吸收处284 nm[41]。

针对具有不同母核的化合物，有两种检测波长的选择方式是目前常用的。第一种是分段变波长测定，例如清清颗粒中同时测定多种指标成分时，在0分钟～18分钟时，选择没食子酸、白芍苷和芍药苷的最大吸收237 nm；在18分钟～ 24分钟，选择甘草苷的最大吸收237 nm；24分钟～ 32分钟，选择黄芩苷的最大吸收280 nm；32分钟～ 34分钟，选择小檗碱的最大吸收345 nm；34分钟～ 40.4分钟，选择汉黄芩苷、黄芩素的最大吸收280 nm[29]。第二种是选择待测物之间共有的吸收波长区。例如玄参饮片中肉桂酸是有机酸类化合物，最大吸收波长为268 nm；哈巴俄苷、哈巴苷属于环烯醚萜类化合物，前者最大吸收波长为278 nm，后者最大吸收波长为202 nm，综合三者共有的平坦吸收区，最终选择290 nm作为检测波长[39]。

这些常用的检测波长选择方式各有利弊，目前有研究者采用新技术，如全时段多波长融合技术运用于检测波长的选择[34]，通过DAD全波长扫描，确定采样波长，并利用Matlab编程软件对各波长进行融合，以全面反应该药中各类成分的信息。该方法较传统方法更加全面、完善地反映所有化学成分的信息，但是对研究者的编程能力和实验条件提出了更高的要求。

3.4 色谱系统不同产生的误差

在QAMS中，所有引起检测器响应值变化的因素都可能引发误差，从而导致试验数据出现偏移。因此在运用QAMS法时，必须对该方法的耐用性和系统适应性进行评价。Qiao Fx等[42]在用QAMS法对川芎进行质量控制的研究过程中，考察了不同仪器、不同色谱柱、不同流速和柱温对RCF的影响，结果显示，测定条件的微小改变对RCF影响不大，RCF重现性良好。目前已经发表的文献中，待测成分RCF的耐用性考察普遍采用此类方法，如果不同条件下的RCF偏移较大，则应增加限定，从而减少误差。

4 结语

QAMS法实现了中药多成分的定量，符合传统中医理论的整体观，同时解决了中药对照品缺乏所引起的质量控制难题，弥补了中药指纹图谱技术模糊性的缺点，大幅降低了中药质量检测的时间和成本。目前的中药质量控制方法主要有化学模式识别法、中药指纹图谱技术、有效成分与药效相结合、QAMS法及其类似等方法，可以考虑将这些方法结合起来，综合运用，建立更加完善的中药质量控制模式。

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(本文编辑： 韩虹娟)

Application and key problems of QAMS for quality control of traditional Chinese medicine

CHENYang,XUGuanglin,XUDesheng,etal.

DepartmentofPharmacy,AffiliatedShuguangHospital,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200021,China

LIULi,E-mail:liuli2750@163.com

The characters of traditional Chinese medicine(TCM) are multicomponent and multitargeted, which decide the mode of quality control of TCM must be multi component and multi index. However, it is difficult to obtain the reference substance of traditional Chinese medicine, which hinders the development of the mode, and also restricts the development of the modernization of TCM. QAMS is an analytical method to use one reference substance of TCM to calculate multi-components. In this article, the principle and the research progress of QAMS are summarized, and the key problems in the process of the research are also discussed.

Quantitative analysis of multi-components by single-marker； Traditional Chinese medicine； Quality control

2013年国家临床重点专科(中医专业)临床药学建设项目(财社[2013]239号)；上海市科技专项计划项目(12401901401)

200021 上海中医药大学附属曙光医院药剂科[陈杨(硕士研究生)、徐光临(博士研究生)、徐德生、刘力]

陈杨(1992- )，女，2014级在读硕士研究生。研究方向：药剂学。E-mail：chenyang4231@163.com

刘力(1961- )，女，硕士，教授。研究方向：新药制剂研究。E-mail：liuli2750@163.com

R284.1

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.05.037

2016-08-21)