龟裂秃马勃的分子鉴定及生物学特性

田亚琴 牛玉蓉 +刘宇 +李华敏 +王守现

摘要：以1株野生马勃属菌株为研究对象，通过核糖体rRNA基因内转录间隔区（ITS）序列分析鉴定为龟裂秃马勃。以菌丝生长速度、菌丝干质量、菌丝生长势为指标，研究其生物学特性。结果表明，龟裂秃马勃的最适碳源为淀粉，最适氮源为尿素，最适碳氮比为20 ∶[KG-*3]1，最适温度为28 ℃，最适生长因子为维生素B6，最适pH值为5.0。

关键词：龟裂秃马勃；鉴定；组织分离；生物学特性

中图分类号： S646.01文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）04-0109-03

龟裂秃马勃（Calvatia utriformis，Handkea utriformis），别称浮雕秃马勃、龟裂马勃，是马勃菌目马勃菌科秃马勃属真菌[1]。其子实体中等至大型，陀螺形，宽6～10 cm，高8～12 cm，白色，渐变为淡锈色，最后变浅褐色；外包被常龟裂，内包被薄，顶部裂成碎片，露出青色的产孢体，基部的不孕体大，并有一横膜与产孢体分隔开；孢子球形，光滑，青黄色，直径3.0～4.5 μm，内含1个油点；孢丝丝状，稍分枝，青黄色，易断。刘波早在1984年报道，龟裂秃马勃具有止血、消毒、解毒等药用功效[2]。目前，国内对龟裂秃马勃的研究较少，且多偏向于医学方面。邓志鹏等概述了马勃的药理作用和临床应用，为其进一步开发利用提供依据[3]；徐力等探讨了大马勃（C. gigantea）提取液体外抗肿瘤作用[4]；郭玫等对马勃进行了系统研究，从生药学、品质评价、化学成分、药理研究等方面作了概述[5]。

尽管许多研究表明马勃具有很高的经济价值和药用价值，但是对于马勃驯化栽培的研究鲜有报道。近年来，笔者从野外采集了1株秃马勃属真菌，编号为JZB2115010，对其进行分子鉴定，并以菌丝生长速度、菌丝干质量、菌丝生长势为指标，开展生物学特性的研究，以筛选出较佳生长条件，为其人工驯化栽培提供基础数据。

1材料和方法

1.1培养基材料

1.1.1综合PDA培养基

马铃薯200 g、琼脂20 g、葡萄糖20 g、大豆蛋白胨5 g、KH2PO4 3 g、MgSO4 1.5 g、维生素B1 10 mg，加水至1 000 mL。

1.1.2基础培养基

葡萄糖20 g、大豆蛋白胨2 g、KH2PO4 1 g、MgSO4 0.5 g、维生素B1 10 mg、琼脂16 g，加水至 1 000 mL。

1.1.3加富培养基

葡萄糖20 g、大豆蛋白胨2 g、马铃薯200 g、KH2PO4 1 g、MgSO4 0.5 g、维生素B1 10 mg、琼脂16 g，加水至1 000 mL。

1.2野生菌母种分离

2010年8月25日在北京市房山区蒲洼林地采集1种秃马勃属真菌，组织分离获得该野生菌的母种。

1.3野生菌株分子鉴定

利用核糖体rRNA基因内转录间隔区（ITS）序列的通用引物ITS4和ITS5对分离的野生菌株进行ITS-PCR鉴定[6-9]。

1.4同步菌丝制备

母种纯化分离好后转接到PDA培养基上，待菌丝基本长满培养皿时，用6 mm的打孔器在菌丝边缘打孔，用接种针挑取菌块转接到PDA培养皿的中央，置于25 ℃培养箱中避光培养，以获得相同菌龄的菌丝，保证后续生物学特性研究的准确[9]。

1.5野生菌株生物学特性研究

碳源、氮源、碳氮比、生长因子、温度、pH值的测定，参照文献[9-11]中的方法。

菌丝日生长速度、菌丝干质量、菌丝生长势的测定，参照文献[9]中的方法。

2结果与分析

2.1野生菌株的鉴定结果

用ITS4、ITS5通用引物对野生菌株的DNA进行扩增、测序。将测序结果提交至GenBank，登录号为JQ293098.1。BLAST分析表明，野生菌JZB2115010扩增序列与登录号为EU833659.1、JN411549.1的龟裂秃马勃（H. utriformis）同源性均达到99%。因此，结合图1子实体形态可确定分离菌株为龟裂秃马勃。

2.2.4生長因子对龟裂秃马勃菌丝生长的影响

由表4可知，不同生长因子对龟裂秃马勃菌丝生长有一定影响，其中维生素B6处理的菌丝生长速度最快，达1.45 mm/d，但与维生素C、玉米浆、维生素B2、肌醇处理差异不显著。在菌丝干质量方面，维生素B2的干质量最高，达0.082 0 g，但与肌醇、维生素B6、维生素C处理差异不显著；对照和维生素B1处理菌丝干质量最低，但差异不显著。在菌丝生长势方面，维生素B6处理表现最好，菌丝洁白浓密；对照和维生素B1处理表现最差。综合考虑，龟裂秃马勃的最适生长因子为维生素B6。

2.2.5温度对龟裂秃马勃菌丝生长的影响

2.2.6pH值对龟裂秃马勃菌丝生长的影响

由表6可知，不同pH值对龟裂秃马勃菌丝生长影响明显。龟裂秃马勃菌丝在pH值为 4.5～8.0范围内均能生长；在pH值为4.5～60时，菌丝洁白，生长势强；当pH值为5.0时，菌丝生长最快，达1.63 mm/d，pH值为5.5时，长速为 1.60 mm/d，二者差异不显著；pH值为8.0时，菌丝生长速度最慢，仅为 0.96 mm/d。从菌丝体干质量来看，pH值为5.0时，菌丝体干质量最高，为0.253 7 g，且与pH值为4.5、5.5、6.0的处理之间差异不显著；pH值为7.5时菌丝干质量最低，仅为0039 9 g，与pH值为8.0的处理差异不显著。从菌丝生长势来看，pH值为5.0时菌丝长势最旺；其次是pH值为4.5、5.5、6.0处理；菌丝在pH值为8.0长势最弱。因此，综合以上分析，本试验选取的最适pH值为5.0。

3讨论与结论

龟裂秃马勃子实体鲜嫩可食，营养丰富，有益于人体健康，既具有经济价值，又具有药用价值。因此，对龟裂秃马勃进行生物学特性研究，有助于更好地培育龟裂秃马勃，促进其开发利用。本研究表明，龟裂秃马勃最适碳源是淀粉，这一结果与贺新生等报道的双环林地蘑的最适碳源一致[12]，当龟裂

秃马勃以其他成分为碳源时，菌丝可以生长，但长势不好，其中以乳糖长势表现最差。在氮源利用方面，龟裂秃马勃最适氮源是尿素，在黄豆粉上表现最差，该结果与张国广等报道的野生小马勃的最适氮源为黄豆粉和麦麸混合物的结果不一致[13]，这可能是因为小马勃和龟裂秃马勃同属不同种，故对氮源利用存在差异；此外，本研究结果与陈芝兰等报道的黑脉羊肚菌[14]和黄春燕等报道的大球盖菇[15]的最适氮源相一致。最适碳氮比是20 ∶[KG-*3]1，这与邹莉等对亚侧耳所报道的适宜碳氮比[10]相一致。最适生长因子是维生素B6，这与丁珊珊等对野生裸盖菇L-001菌株报道的最适生长因子[16]相一致。最适温度为28 ℃，这一结果与张国广等报道的野生小马勃的最适温度[13]相一致，当温度高于36 ℃时龟裂秃马勃不生长，另外笔者近年来研究发现，多数食用菌的最适生长温度为28 ℃[9，17]。最适pH值为5.0，这一结果与张国广等报道野生小马勃的最适pH值不一致，其最适pH值为5.5[13]，两者差别不大，可能是由于试验误差造成的数据不一致，但由此可知马勃属大多适宜在较低pH值的环境下生长。目前，未见其他关于龟裂秃马勃最适氮源、碳源、碳氮比及最适生长因子的综合研究报道，本研究可为龟裂秃马勃的人工驯化栽培提供基础数据。

参考文献：

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