P120-连环蛋白介导钙黏蛋白转换促进口腔鳞状细胞癌细胞迁移和侵袭的实验研究

陈钟 张美 徐勇

1.厦门医学院口腔医学系，厦门 361008；2.山东省高青县人民医院口腔科，高青 256300

·口腔肿瘤学专栏·

P120-连环蛋白介导钙黏蛋白转换促进口腔鳞状细胞癌细胞迁移和侵袭的实验研究

陈钟1张美2徐勇1

1.厦门医学院口腔医学系，厦门 361008；2.山东省高青县人民医院口腔科，高青 256300

目的 探索P120-连环蛋白（P120ctn）在口腔鳞状细胞癌（OSCC）细胞钙黏蛋白转换中的作用及其对肿瘤细胞迁移和侵袭的影响。方法采用质粒pGFP-V-RS-P120ctnshRNA转染OSCC细胞株TSCCA，采用实时荧光定量聚合酶链反应、Western blot检测细胞中P120ctn、E-钙黏蛋白（E-cad）和N-钙黏蛋白（N-cad）的mRNA和蛋白表达的变化，通过Transwell细胞侵袭及细胞迁移实验检测转染前后细胞迁移和侵袭能力的变化。结果质粒pGFP-V-RSP120ctnshRNA转染TSCCA细胞后，P120ctn表达明显降低，E-cad的mRNA和蛋白表达水平也明显降低，而N-cad的mRNA和蛋白表达水平明显提高，细胞迁移和侵袭能力也明显提高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论在OSCC中P120ctn可能通过介导钙黏蛋白转换来调节肿瘤的浸润和转移过程。

P120-连环蛋白； 钙黏蛋白转换； 口腔鳞状细胞癌

肿瘤的侵袭转移包含多个信号转导通路，过程复杂，步骤繁多，其中细胞黏附能力下降是一个重要环节。钙黏蛋白是一种钙离子依赖型细胞黏附分子。口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell cancer， OSCC）发生发展过程中有钙黏蛋白转换现象，并且与肿瘤侵袭和转移相关[1]。钙黏蛋白转换，是指上皮细胞E-钙黏蛋白（E-cadherin，E-cad）表达的丧失和N-钙黏蛋白（N-cadherin，N-cad）等间质钙黏蛋白表达的上调，是上皮-间质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）的重要步骤。研究[2]表明，P120-连环蛋白（P120-catenin，P120ctn）和E-cad可能通过调节细胞黏附调控OSCC浸润和转移，但与钙黏蛋白转化的关系尚未阐明。本研究通过基因转染方法，探讨P120ctn在OSCC细胞株TSCCA钙黏蛋白转换中的作用及其对细胞迁移和侵袭的影响。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

鼠抗人P120ctn单克隆抗体、鼠抗人E-cad单克隆抗体（Abcam公司，美国），兔抗人N-cad多克隆抗体（Santa Cruz公司，美国）。pGFP-V-RS-P120ctnshRNA（Origene公司，加拿大），X-treme Gene HP DNA转染试剂（Roche公司，瑞士）。DMEM培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Gibco公司，美国），TRIzol试剂（Invitrogen公司，加拿大），逆转录试剂盒（TaKaRa公司，日本）。CO2培养箱（Thermal公司，美国），倒置相差显微镜（Olympus公司，日本），荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪（Corbett公司，美国），Transwell小室（Corning公司，美国）。

1.2 基因转染及筛选

细胞培养皿中接种约3×105个TSCCA细胞，常规培养24 h。100 μL DMEM无血清培养基溶解1 μg pGFP-V-RS-P120ctnshRNA质粒和3 μL转染试剂，然后将混合物加入TSCCA细胞中，轻柔混匀，15～25 ℃孵育30 min。37 ℃孵育24 h后施加筛选压力，改用含0.8 μg·mL-1嘌呤霉素的培养基培养。反复筛选2～3周后，收集具有嘌呤霉素抗性的细胞克隆增殖，命名为TSCCA/shP120ctn细胞，对照组为未做任何处理的TSCCA细胞。

1.3 实时荧光定量PCR

引物合成委托上海生工生物工程公司完成。采用指数生长期细胞抽提总RNA，定量逆转录为cDNA。反应体系为Oligo dT primer（50 μmol·L-1）1 μL，dNTP Mixture 1 μL，Total RNA 5 μg，加入不含RNA酶dH2O补至10 μL，在PCR仪上进行逆转录PCR反应，反应条件如下：42 ℃ 15 min，70 ℃ 30～60 min，-20 ℃保存。PCR扩增反应条件为94 ℃ 5 min，93 ℃预变性30 s，59 ℃变性45 s，72 ℃退火60 s，71 ℃延伸7 min，35个循环。

1.4 Western blot

收获指数生长期细胞的蛋白质，提取蛋白上样，加入琼脂糖凝胶，10 mA电泳2 h，根据相对分子质量Marker截取目的条带，100 V衡压1 h，湿转到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗4 ℃摇动孵育过夜，洗去一抗，辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）标记IgG与滤膜一同温育洗膜曝光。

1.5 Transwell细胞侵袭及细胞迁移实验

迁移实验采用培养基和Transwell小室，置于37 ℃条件下温育。消化对数生长期的TSCCA和TSCCA/ shP120ctn细胞，加入无血清培养基，调整细胞密度为每毫升2×105个，上室加入200 μL细胞悬液，下室加入800 μL含20%FBS的培养基，48 h后进行固定、染色，计算并统计结果。侵袭试验在Transwell上室底部中央垂直加入100 μL稀释后的Matrigel，37 ℃温育4 h使其干成胶状，后续步骤同迁移试验。

1.6 统计学方法

数据处理采用SPSS 19.0统计软件，组间比较采用方差分析法，检验水准为双侧α=0.05。

2 结果

2.1 P120ctnshRNA转染对TSCCA细胞钙黏蛋白转换的影响

用质粒pGFP-V-RS-P120ctnshRNA转染TSCCA细胞后发现，随着P120ctn表达的显著降低，E-cad的mRNA和蛋白表达水平明显降低，N-cad的mRNA和蛋白水平则明显升高，差异均具有统计学意义（P＜0.05）（图1、2）。

图1 P120ctnmRNA、E-cad mRNA和N-cad mRNA在TSCCA和TSCCA/shP120ctn细胞中的表达Fig1 Expression of P120ctnmRNA, E-cad mRNA and N-cad mRNA in TSCCA and TSCCA/shP120ctn

2.2 P120ctnshRNA转染对TSCCA细胞迁移和侵袭能力的影响

利用无基质胶以及有基质胶Transwell实验检测TSCCA细胞转染P120ctnshRNA前后迁移和侵袭能力的变化，结果见图3。转染前，迁移实验穿过Transwell小室微孔的细胞数量为每视野59个，侵袭实验为52个；转染后，迁移实验为每视野119个，侵袭实验为102个，可见TSCCA细胞转染P120ctnshRNA后迁移和侵袭能力显著提高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 P120ctn、E-cad和N-cad蛋白在TSCCA和TSCCA/shP120ctn细胞中的表达Fig2 Expression of P120ctn, E-cad and N-cad protein in TSCCA and TSCCA/shP120ctn

图3 TSCCA细胞和TSCCA/shP120ctn细胞的迁移和侵袭能力对比Fig3 Contrast of migration and invasion capacity of TSCCA and TSCCA/shP120ctn

3 讨论

钙黏蛋白是钙依赖的细胞与细胞之间粘连作用关键的细胞黏附调节分子，目前已发现30多种钙黏蛋白，分布于不同的组织细胞上，如上皮细胞的E-cad、神经细胞的N-cad和胎盘滋养层细胞的P-钙黏蛋白（P-cadherin，P-cad）以及心肌细胞上的N-cad等。肿瘤细胞之间通过钙黏蛋白的作用而发生黏附，聚集成团，不易脱落进入周围组织。肿瘤的转移首先是肿瘤细胞从原发灶的脱落，因此与钙黏蛋白的作用密切相关。如果钙黏蛋白的表达异常，就会使这种黏附作用削弱，容易发生转移。

P120ctn是连环蛋白家族的新成员，参与细胞黏附和信号传导，通过与经典钙黏蛋白，包括E-cad、N-cad和P-cad的胞内肽段近膜端（juxtamembrane domain，JMD）结合形成连环蛋白-钙黏蛋白复合体（cadherin catenin complex，CCC）。P120ctn不同于其他几种连环蛋白，它与经典钙黏蛋白之间的连接并不紧密，因此P120ctn的主要作用在于调节而非物理性连接[3]。

本实验结果发现，E-cad的mRNA和蛋白表达水平在P120ctnshRNA转染舌癌原发灶细胞TSCCA后明显降低。P120ctn蛋白水平的降低或P120ctn与E-cad结合的丧失使之从CCC脱离，导致钙黏蛋白的内吞，内吞的钙黏蛋白或者被溶酶体降解，或者通过与P120ctn结合和RAS小GTP结合蛋白1（a small GTP-binding protein of the RAS，Rap1 GTPase）被回收到细胞膜，因此P120ctn对于E-cad这种动静结合的调节是非常重要的。P120ctn与E-cad结合的关键部位同时也是磷酸化位点，P120ctn上Y228位点的磷酸化与OSCC的发生密切相关[4]，几个酪氨酸和丝氨酸位点的磷酸化都与钙黏蛋白的活化和黏附能力相关[5]，P120ctn可能就是通过磷酸化调节了E-cad的结合和稳定性，从而影响CCC的稳定性，使细胞黏附能力发生异常。

此外，本研究还发现，P120ctnshRNA转染TSCCA后，随着E-cad表达水平的降低，N-cad的表达水平显著增高，且TSCCA细胞迁移和侵袭的能力显著增高，提示N-cad的表达和钙黏蛋白转换可能与OSCC的浸润和转移有关。这与前人的研究结果一致。Byrd等[1]应用免疫组织化学法观察了93例OSCC病理切片，发现钙黏蛋白转换的发生与OSCC患者的预后不良有相关性。在许多实体肿瘤中，肿瘤细胞都发生了钙黏蛋白转换，并且被认为是肿瘤侵袭的起始步骤[6-8]，并且，E-cad表达下调而N-cad表达上调的“钙黏蛋白转换”促进了肿瘤细胞的迁移和侵袭，并与不良预后有关[9-10]。

在钙黏蛋白转换机制的研究[11]中发现，如果在上皮细胞中强制表达N-cad，则内生性E-cad加速降解，表达水平下调。在A431细胞中，强制表达R-钙黏蛋白（R-cadherin，R-cad）导致了内生性E-cad和P-cad的降解，这种降解是因为钙黏蛋白竞争性结合于P120ctn所致[12]。钙黏蛋白转换可能发生在某一个钙黏蛋白转录调节之后，生长因子诸如转化生长因子β导致了E-cad的转录抑制，也通过释放P120ctn，使之结合于N-cad，间接提高了N-cad的表达，并将其稳定于细胞表面[13]。

钙黏蛋白转化过程中肿瘤细胞的恶性行为可能与N-cad/血小板衍生生长因子受体的相互作用或N-cad/成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor，FGFR）的相互作用有关。前者可能诱导了EMT过程中的一些重要事件，包括肌动蛋白重组、增殖和迁移；后者可能通过与成纤维细胞生长因子结合抑制了FGFR的内化，活化了丝裂原活化蛋白激酶，提高了细胞运动能力，促进了基质金属蛋白酶的分泌和肿瘤细胞的侵袭。

综上所述，由本研究结果可以推测，在OSCC中P120ctn可能通过介导钙黏蛋白转换参与调节OSCC的浸润和转移。

[1] Byrd KM, Aljadeff L, Bellile EL, et al. Cadherin switching, Twist, and Bmi-1 expression at the invasive front correlate with aggressive disease in oral squamous cell carcinoma patients: molecular biology and therapeutics[J]. Int J Radiat Oncol, 2014, 88(2):514.

[2] 陈钟, 董孟华, 邓锋. P120ctn在口腔鳞癌中的表达及其与细胞黏附的关系[J]. 口腔医学研究, 2013, 29(11):1051-1053.

Chen Z, Dong MH, Deng F. Correlation between the expression of P120ctnand the cell adhesion in the oral squamous carcinoma[J]. J Oral Sci Res, 2013, 29(11):1051-1053.

[3] Ozaki C, Yoshioka M, Tominaga S, et al. p120-Catenin is essential for N-cadherin-mediated formation of proper junctional structure, thereby establishing cell polarity in epithelial cells[J]. Cell Struct Funct, 2010, 35(2):81-94.

[4] Petrova YI, Spano MM, Gumbiner BM. Conformational epitopes at cadherin calcium-binding sites and p120-catenin phosphorylation regulate cell adhesion[J]. Mol Biol Cell, 2012, 23(11):2092-2108.

[5] Ma LW, Zhou ZT, He QB, et al. Phosphorylated p120-catenin expression has predictive value for oral cancer progression [J]. J Clin Pathol, 2012, 65(4):315-319.

[6] Gravdal K, Halvorsen OJ, Haukaas SA, et al. A switch from E-cadherin to N-cadherin expression indicates epithelial to mesenchymal transition and is of strong and independent importance for the progress of prostate cancer[J]. Clin Cancer Res, 2007, 13(23):7003-7011.

[7] ElMoneim HM, Zaghloul NM. Expression of E-cadherin, N-cadherin and snail and their correlation with clinicopathological variants: an immunohistochemical study of 132 invasive ductal breast carcinomas in Egypt[J]. Clinics, 2011, 66 (10):1765-1771.

[8] Hazan RB, Qiao R, Keren R, et al. Cadherin switch in tumor progression[J]. Ann N Y Acad Sci, 2004, 1014:155-163.

[9] Fan M, Liu Y, Xia F, et al. Increased expression of EphA2 and E-N cadherin switch in primary hepatocellular carcinoma[J]. Tumori, 2013, 99(6):689-696.

[10] Lade-Keller J, Riber-Hansen R, Guldberg P, et al. E- to N-cadherin switch in melanoma is associated with decreased expression of phosphatase and tensin homolog and cancer progression[J]. Br J Dermatol, 2013, 169(3):618-628.

[11] Nieman MT, Prudoff RS, Johnson KR, et al. N-cadherin promotes motility in human breast cancer cells regardless of their E-cadherin expression[J]. J Cell Biol, 1999, 147(3): 631-644.

[12] Maeda M, Johnson E, Mandal SH, et al. Expression of inappropriate cadherins by epithelial tumor cells promotes endocytosis and degradation of E-cadherin via competition for p120ctn[J]. Oncogene, 2006, 25(33):4595-4604.

[13] Wheelock MJ, Shintani Y, Maeda M, et al. Cadherin switching[J]. J Cell Sci, 2008, 121(Pt 6):727-735.

（本文编辑 吴爱华）

Cadherin switching induced by P120-catenin can promote the migration and invasion of oral squamous cell cancer cells

Chen Zhong1, Zhang Mei2, Xu Yong1. (1. Dept. of Stomatology, Xiamen Medical College, Xiamen 361008, China; 2. Dept. of Stomatology, Gaoqing People’s Hospital in Shandong Province, Gaoqing 256300, China)

Objective The main goal is to investigate the role of P120-catenin (P120ctn) in cadherin switching, as well as migration and invasion, of oral squamous cell cancer (OSCC) cells.MethodsThe plasmid pGFP-V-RS-P120ctnshRNA was used to transfect TSCCA cells and significantly reduce the expression of P120ctnin these cells. Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction and Western blot were conducted to determine the mRNA and protein expression levels of P120ctn, E-cadherin (E-cad), and N-cadherin (N-cad). By contrast, the Transwell cell invasion and cell migration assay was used to determine the invasion and migration capacities before and after the transfection.ResultsAfter the plasmid pGFPV-RS-P120ctnshRNA was transfected into the TSCCA cells, we found that as the P120ctnexpression significantly decreased, E-cad mRNA and protein expression decreased significantly. Moreover, N-cad mRNA and protein expression increased significantly (P＜0.05). Lastly, the cell migration and invasion capacities were augmented significantly (P＜0.05). Conclusion In OSCC cells, P120ctnmay be involved in cadherin switching and promote metastasis and invasion.

P120-catenin; cadherin switching; oral squamous cell cancer

R 739.8

A

10.7518/hxkq.2017.02.014

Supported by: Project Supported by Natural Science Foundation of Xiamen Medical College (2013-02). Correspondence: Chen Zhong, E-mail: 310571932@qq.com.

2016-10-15；

2016-12-22

厦门医学院自然科学基金（Z2013-02）

陈钟，副教授，博士，E-mail：310571932@qq.com

陈钟，副教授，博士，E-mail：310571932@qq.com