Ⅱ型巨指症神经脂肪浸润的病理改变

杨 茜 蒋永康 周晟博 王 斌

Ⅱ型巨指症神经脂肪浸润的病理改变

杨 茜 蒋永康 周晟博 王 斌

目的研究Ⅱ型巨指症患者增粗神经的超微结构与功能蛋白表达。方法以多指正常结构指神经为对照，电镜下观察Ⅱ型巨指症患者增粗神经的超微结构；免疫荧光染色评价S100、LN和H3K27me3的表达水平。结果在巨指症增粗神经中，有髓神经纤维数目显著减少，部分有髓纤维的髓鞘板层结构皱缩、破坏，施万细胞的数量无明显改变。在巨指和正常对照的神经纤维中，S100的表达没有显著差异；LN在正常指神经中，呈现弥散表达或低表达，而在部分巨指增粗神经中为点状阳性表达；H3K27me3在巨指增粗神经组织和正常指神经组织中均为阳性表达。结论Ⅱ型巨指症神经纤维瘤病变为良性增生，部分髓鞘损害；机体可以功能代偿。因此，临床需根据患者神经的损伤与代偿情况，选择Ⅱ型巨指症神经的保留或切除。

巨指症电镜免疫荧光

先天性巨指（趾）症可单一指（趾）发病，也可累及多指（趾），可同时有并指（趾）和斜指（趾）畸形[1]。Flatt将先天性巨指症分为4型，Ⅰ型为脂肪增生及脂肪纤维瘤型；Ⅱ型为脂肪增生伴神经纤维瘤型，常合并神经增粗，伴或不伴骨骼增生；Ⅲ型为脂肪增生伴骨肥大型，骨异常增生常造成骨及邻近关节的畸形；Ⅳ型为偏身肢体肥大型[2]（图1）。

图1 Ⅱ型巨指症中脂肪浸润的增粗神经Fig.1 The enlarged nerve with adipose infiltration in typeⅡmacroldactyly

临床对于Ⅱ型巨指的治疗，主要以纠正形态异常以及截指等术式为主[3]，而对于神经功能方面的考虑较少。但对于患者而言，指神经功能是否存在和术后的有效保留十分重要，尤其是儿童。目前，由于缺乏对增粗神经的相关基础研究，尤其是微观形态学观察，及其功能蛋白表达的了解，故很难确定术中需要部分保留还是完整切除增粗的神经。因此，我们观察Ⅱ型巨指病理性增粗神经超微结构的改变，同时比较其与正常指神经在S100、LN和H3K27me3等表达的差异，为Ⅱ型巨指症神经的功能评价和手术改进提供依据。

1 资料与方法

1.1 患者资料

2015年1月至2016年1月，我们收集了9位Ⅱ型巨指症患儿的12个神经样品，并以3个复拇畸形患者切除指中的神经组织为对照。患者年龄为0.5～15岁（平均2.75岁）。术前我们测量了患者患指和对侧健指的静态两点辨别觉，即2-SPD（部分患儿年龄过小无法依从）。本研究获患者及其父母知情同意，经上海交通大学医学院伦理委员会批准（表1）。将获取的神经组织分为两部分，分别用于电子显微镜检查和免疫荧光染色。

表1 患者信息与主观感觉功能评价Table1 Patient information and subjective sensory

1.2 主要试剂与仪器

anti-S100、anti-H3K27me3（Abcam，英国），Cy3 AffiniPure通用山羊抗小鼠IgG（EarthOx Life Sciences，美国），DAPI（Invitrogen，美国）。

Eclipse 90i光学显微镜（Nikon，日本），电子显微镜（Philips CM-120，荷兰），Shandon Finesse 325手动旋转切片机（Thermo Shandon，英国），Eclipse 90i倒置荧光显微镜（Nikon，日本）。

1.3 方法

1.3.1 超微结构观察

将巨指增粗神经组织和正常指神经对照组织在2.5%中性戊二醛中固定2 h，PBS洗涤后，将样品于4.0℃下1.0%四氧化锇中固定2 h，在30%、50%、70%乙醇中逐级脱水，每次10 min，置于环氧丙烷中10 min，并在含有3.0%乙酸双氧铀的70%乙醇中干燥。将环氧丙烷用环氧树脂逐级置换直至纯树脂，37℃聚合过夜，60℃干燥48 h。树脂包埋，2.0 mm厚度切片，甲苯胺蓝染色，Eclipse 90i光学显微镜定向，然后用乙酸双氧铀染色超薄切片（100 nm），并在80 KV下电镜观察。

1.3.2 免疫荧光染色

4.0 %多聚甲醛浸泡1 h，OCT下低温包埋，Shandon Finesse 325手动旋转切片机切割成5 mm厚度用于免疫荧光染色。在使用微波修复抗原后，将切片于37℃下在3.0%BSA中封闭30 min，加入一抗，4.0℃湿盒中温育过夜，PBS洗涤15～20 min。免疫荧光染色的一抗为anti-S100（1∶200，ab4066）和anti-H3K27me3（1∶200，ab6174）。加入二抗，在37℃黑暗下孵育50 min。二抗为Cy3 AffiniPure通用山羊抗小鼠IgG（1∶200，E031610）。DAPI（1∶500）用于核染色，并在Eclipse 90i倒置荧光显微镜下观察（Cy3红色激发波长510～560 nm，发射波长590 nm）。

2 结果

2.1 Ⅱ型巨指（趾）症神经组织学及超微结构改变

与正常指神经相比，巨指神经HE染色显示神经束增粗，局部有明显脂滴浸润，神经显微结构完整，无异形细胞（图2）。电镜下，有髓神经纤维在正常指神经组织中集中分布，与正常指神经相比，乙酸双氧铀/柠檬酸铅染色切片显示巨指症神经有髓神经纤维数目显著减少，一些有髓纤维的髓鞘板层结构皱缩、破坏。此外，施万细胞的数量和形态无明显改变（图3）。

图2 指神经HE染色Fig.2 HE Staining of digital nerves

图3 指神经超微结构（标尺：A、B为2 μm；C、D为5 μm）Fig.3 Ultra-structural of digital nerves (scale of A,B:2 μm;scale of C,D:5 μm)

2.2 病理增粗神经的免疫荧光染色

巨指神经组织和正常指神经组织均显示S100阳性染色。在两种神经中，S100的表达没有显著差异（图4A-D）。LN在正常指神经中呈现为稍均质的弥散表达或低表达，而在部分巨指增粗神经样本中，LN为点状阳性表达（图4E-H）。此外，H3K27me3在巨指增粗神经和正常指神经组织中均阳性表达。

图4 Ⅱ型巨指症神经功能蛋白的表达（标尺：100 μm）Fig.4 Functional protein expression of enlarged nerves in typeⅡmacrodactyly(Scale:100 μm)

3 讨论

对于Ⅱ型巨指症，是否全部切除增粗的神经是困扰整形外科和手外科的难题[3-5]。这主要是由于缺乏对Ⅱ型巨指症神经脂肪浸润病理改变的认识。而手的神经感觉功能对于患者而言十分重要，尤其是儿童。此外，先天性巨指症是一类与PIK3CA体细胞突变相关的增生性疾病。目前发现，PIK3CA在乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌等恶性肿瘤中呈现高突变率，以p.H1047R最为多见，被认为是一种癌基因，与肿瘤的发生发展关系密切。因此，不少学者认为Ⅱ型巨指神经纤维瘤存在恶变的可能性[6-8]。

已有的文献报道均认为，Ⅱ型巨指增粗的神经表现为纤维脂肪错构瘤样改变[9-10]，神经被增厚的神经内膜结缔组织分隔，神经组织周围脂肪浸润。本研究发现，相较正常指神经，Ⅱ型巨指增粗的神经超微结构发生明显改变，表现为有髓神经减少和髓鞘损伤（图2A-B）。在9 700倍视野中，可见部分有髓神经纤维髓鞘结构破坏，板层结构皱缩，神经丝消失。我们发现，大多数患者受累部位的2PD等感觉功能评价指标明显下降，体现了神经形态改变与功能影响的一致性。

S100锚定于细胞质或细胞核中的钙结合蛋白，主要在周围神经中的施万细胞（Schwann cell）中表达[10]。Kini等[11]报道，在巨指神经束的施旺细胞中发现S100的强阳性表达。Plaza等[9]认为，S100在施万细胞中为阳性表达，而在神经束膜上无表达。我们的结果显示，S100在巨指增粗神经中阳性表达，但与正常指神经相比，两种神经之间的荧光强度没有显著差异。电镜结果亦证实，巨指症增粗神经束中的施万细胞数量与正常指神经相比无明显差异，我们推断，在巨指病理性增粗神经中施旺细胞的比例没有显著变化。

目前认为，LN与神经细胞的运动、分化及肿瘤的转移关系密切。许多研究都表明LN是机体中一种重要的糖蛋白组分。LN是1个长臂和3个短臂组成的大分子量糖蛋白，是各种组织基底膜的重要组成部分，由α、β和γ3个链组成。在胚胎和新生期，LN在周围神经内膜管的内表面有较多表达，靠其浓度梯度引导神经细胞和神经纤维生长方向，成年期表达较少[12-13]。研究认为，坐骨神经损伤后，LN的表达重新增多可能与SC的增殖并大量分泌LN从而使其发挥神经导向和神经营养因子的作用有关[14-15]。在巨指症增粗神经中，我们同样发现了LN的再聚集和高表达，提示该部位神经损伤后可能存在修复机制。在部分患者中我们发现，其肢体巨大，术中同样观察到神经粗大，而术前2PD指标的下降程度与疾病严重程度不一致，间接说明了巨指症患者神经损伤后机体启动了某种修复机制，以代偿这种功能下降。

H3K27（H3K27me3）的三甲基化与基因抑制相关。作为一个重要的表观遗传修饰，H3K27me3和其他甲基化修饰，包括H3K4me3，共定位于一些基因组区域，调节细胞表型[16]。恶性周围神经鞘瘤（MPNST）中，H3K27me3的失表达有高度特异性[17]。此外，在MPNST患者中，H3K27me3的失表达可致其生存率明显下降[18]。而在巨指症增粗神经组织中，H3K27me3与正常指神经呈现同样的高表达水平，提示Ⅱ型巨指症中的神经纤维瘤病变为良性增生。

4 总结

综上所述，在Ⅱ型巨指症中，增粗的巨指神经部分髓鞘损害，但机体可能存在某种修复机制以代偿神经损伤。此外，Ⅱ型巨指症中的神经纤维瘤病变为良性增生。因此，对于Ⅱ型巨指症患者，其增粗的神经是全部切除、部分切除或保留，应根据术前客观评价和神经代偿情况决定。

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Pathologic Characters of the Nerve with Adipose Infiltration in TypeⅡMacrodactylyYANG Xi,JIANG Yongkang,

ZHOU Shengbo,WANG Bin．Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Correspondingauthor:WANGBin(E-mail: wangbinl766@163.com).

ObjectiveTo explore the ultra-structural changes and functional protein expression of enlarged nerves in patients with typeⅡmacrodactyly.MethodsThe ultra-structure of the enlarged nerves in typeⅡmacrodactyly patients was observed under electron microscope.The expression of S100,LN and H3K27me3 were evaluated by immunefluorescence staining.Normal digital nerves from polydactyly patients were used as control.ResultsThe number of myelinated fibers was significantly decreased,and some myelinated lamellar structures were shrunk and destroyed.The number and morphology of Schwann cells did not change significantly.There was no significant difference in the expression of S100 between the macrodactyly group and control group.LN was low expressed in the normal digital nerve,and in the enlarged nerve samples,LN showed a stronger expression.In addition,the expression of H3K27me3 in both enlarged nerve tissue and normal nerve tissue were positive.ConclusionThe neurofibromatosis of typeⅡmacrodactyly is benign hyperplasia.In patients with typeⅡmacrodactyly,the sheath of the enlarged nerves was damaged.However,LN positive staining indicates a repair mechanism to compensate for nerve injury.Therefore,the neurosurgical procedures should be determined according to the neurological damage and compensatory situation in patients in typeⅡmacrodactyly.

Macrodactyly;Electron microscopy;Immunofluorescence

R682.1+5

A

1673－0364（2017）02－0073－04

2017年1月8日；

2017年2月14日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.02.004

国家自然科学基金（81271725，81571930）：上海市重中之重临床医学中心项目。

200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科。

王斌（E-mail：wangbinl766@163.com）。