109株草鱼源维氏气单胞菌的耐药性分析

黄锦炉，谭晓晨，彭书华，曾宇鲲，林德杰

（广东海大集团股份有限公司畜牧水产研究中心，广东广州511400）

109株草鱼源维氏气单胞菌的耐药性分析

黄锦炉1，谭晓晨1，彭书华1，曾宇鲲1，林德杰1

（广东海大集团股份有限公司畜牧水产研究中心，广东广州511400）

本实验采用琼脂扩散法，比较分析了109株草鱼源维氏气单胞菌对25种抗生素的耐药情况。结果表明，89%以上的维氏气单胞菌分离株对青霉素和新生霉素产生高度耐药，70%以上的菌株对麦迪霉素、吉他霉素和克拉霉素不敏感，而菌株对强力霉素、诺氟沙星和链霉素敏感性较好，超过80%以上的菌株对氟苯尼考、阿齐霉素、环丙沙星和甲砜霉素表现敏感或高度敏感。

维氏气单胞菌；草鱼；抗生素；耐药性

维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）是一种兼性厌氧的人鱼共患的条件性病原菌［1-2］，具有嗜温和运动性等特性，普遍存在于淡水、海水、淤泥和污水等环境中，可引起人的腹泻［5］、败血症和急性胆管炎［6］、慢性呼吸道［7］等疾病，也可引起多种鱼类患病，危害鱼类品种包括丁鱥（Tinca tinca）［3］和泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）［4］、中华鳖（Pelodiscus sinensis）［5］和斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）［6］、乌鳢（Ophicephalus argus）［7］，不仅危害人类的公共卫生安全，也威胁水产养殖业的健康发展。

维氏气单胞菌对草鱼的养殖危害日益显现，以春秋两季的原发性感染和并发感染的病症最为常见，感染症状上多以草鱼体表不规则斑状出血、出血性肠炎等为主，感染死亡率为5-15%。目前，针对维氏气单胞菌等细菌性疾病的防治仍以抗生素拌饲内服为主，由于养殖生产终端技术条件限制，防治性药物的选择往往缺乏有效的用药参考依据，导致不同区域相似感染案例之间的药物防治效果存在较大差异。因此，本试验以分离自不同年份和区域的草鱼源维氏气单胞菌109株为研究对象，采用琼脂扩散法比较不同维氏气单胞菌分离株的药物敏感性差异，旨在为草鱼源维氏气单胞菌耐药性研究与草鱼养殖终端用药参考提供有应用价值的理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

维氏气单胞菌：109株，分离自不同区域草鱼，由广东海大集团海大研究院保存提供，菌株来源见表1。

表1 109株维氏气单胞菌的来源

续表

1.2 供试抗生素类药物

供试抗生素类药敏纸片共25种，购自杭州微生物试剂有限公司，其中β-内酰胺类：青霉素（10 IU/片），氨苄西林（10 μg/片），头孢拉定（30 μg/片），新生霉素（30 μg/片）；大环内酯类：红霉素（15 μg/片），麦迪霉素（30 μg/片），吉他霉素（15 μg/片），克拉霉素（15 μg/片），阿奇霉素（15 μg/片）；氨基糖苷类：链霉素（10 μg/片），庆大霉素（10 μg/片），卡那霉素（30 μg/片），丁胺卡那霉素（30 μg/片），新霉素（30 μg/片），妥布霉素（10 μg/片）；四环素类：四环素（30μ g/片），强力霉素（30 μg/片），美满霉素（30 μg/片）；氯霉素类：氟苯尼考（75 μg/片），甲砜霉素（30 μg/片）；喹诺酮类：诺氟沙星（10 μg/片），环丙沙星（5 μg/片）；其他：氯洁霉素（2 μg/片），磺胺嘧啶（300 μg/片），多粘菌素B（300 IU/片）。

1.3 细菌的培养

按无菌操作要求，挑取低温保存的维氏气单胞菌接种于LB营养肉汤培养基，30℃条件下120 r/min恒温振荡培养24 h，收集菌液，4 000 r/min离心5 min收集菌体，用生理盐水进行稀释，将稀释菌液与McFarland比浊管进行细菌计数，使受试菌株的菌液终浓度均达到3×107cfu/ml。

1.4 药敏试验

试验方法参考马绪荣等［11］主编的《药品微生物学检验手册》推荐的纸片琼脂扩散法。用无菌棉签浸透生理盐水稀释的菌液，将过量菌液于管壁处加压，旋转挤出，取出棉签并在M-H琼脂培养基表面均匀涂布，将M-H琼脂培养基30℃恒温箱中静置数分钟，使琼脂培养基表面干燥，用无菌镊子将不同的药敏纸片均匀的贴在琼脂培养基的表面，置30℃恒温培养24 h。观察、测量和记录各菌株对供试药敏纸片的抑菌圈直径。试验结果判定参照杭州微生物试剂有限公司提供的判定标准进行。

2 结果与分析

2.1 菌株对β-内酰胺类的耐药性

由表2可知，β-内酰胺类药物对供试维氏气单胞菌的抑制作用较弱，供试源维氏气单胞菌对包括青霉素在内的四种药物具有较严重的耐药性。其中供试维氏气单胞菌对新生霉素耐药率达100%，而对青霉素、氨苄西林和头孢拉定这三种药物的耐药率分别为89.0%、81.6%、77.1%。检测结果显示，维氏气单胞菌对头孢拉定的敏感率最高，达到13.8%，而对青霉素和氨苄西林的敏感率则分别仅为6.4%和9.2%。然而，综合来看，β-内酰胺类药物对供试维氏气单胞菌的体外抑菌效果并不理想。

表2 维氏气单胞菌对β-内酰胺类的耐药性

2.2菌株对大环内酯类的耐药性

由表3可知，大环内酯类药物对供试维氏气单胞菌虽有一定抑制作用，但抑制效果并不理想，多数抑菌圈直径都介于耐药和敏感的之间，其中菌株对克拉霉素的耐药程度最严重，其耐药率达到77.1%，而对吉他霉素和麦迪霉素的耐药率次之，分别为75.2%和71.8%。供试维氏气单胞菌对红霉素的耐药率为26.4%，介于耐药和敏感的菌株数量约达60%。供试维氏气单胞菌对阿奇霉素的敏感性最好，对该药的敏感率高达85.4%，而耐药率仅为13.8%。

表3 维氏气单胞菌对大环内酯类的耐药性

2.3 菌株对氨基糖苷类的耐药性

由表4可知，供试维氏气单胞菌对氨基糖苷类药物的均具有良好的敏感性，超过49%的菌株对6种药物全部敏感，供试菌株对新霉素的敏感率最高，达到73.4%；而供试菌株对庆大霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素和妥布霉素的敏感率依次降低，分别为71.6%、65.1%、54.5%、50.5%和49.5%。另一方面，供试菌株对妥布霉素和卡那霉素介于耐药和敏感之间的比例较高，分别为37.7%和36.7%；然而供试菌株对药物的耐药性最高和最低的品种依次是丁胺卡那霉素（27.3%）、卡那霉素（12.8%）和妥布霉素（12.8%）。

表4 维氏气单胞菌对氨基糖苷类的耐药性

2.4 菌株对四环素类的耐药性

受试菌株对四环素类药的敏感程度大小不一。由表5可知，供试维氏气单胞菌对强力霉素的敏感率达到75.2%，对四环素的敏感率次之，达59.6%，而对美满霉素的敏感率仅有7.3%。另一方面，供试菌株对四环素的耐药率最高，达31.2%；对美满霉素的耐药率仅为15.7%，而对美满霉素介于耐药和敏感之间的比例却约达78%。

表5 维氏气单胞菌对四环素类的耐药性

2.5 菌株对其他抗生素类的耐药性

从由表6可知，氟苯尼考、甲砜霉素对供试维氏气单胞菌具有良好的敏感性，敏感率分别达到93.6%和80.7%。磺胺嘧啶对供试菌株也具有良好的敏感性，其敏感率达63.6%。约69%的供试菌株对林可霉素类的氯洁霉素高度耐药，其敏感率仅为9.1%；约18%的供试菌株对多粘菌素B高度耐药，其敏感率高达41.3%，介于耐药与敏感之间的约占41%。从菌株对人工合成类药物的耐药情况看，对环丙沙星敏感的供试菌株对诺氟沙星也表现敏感，其中对诺氟沙星表现敏感的菌株分别为81.6%和72.5%，然而也有超过13%的供试菌株对环丙沙星和诺氟沙星完全耐药。

表6 维氏气单胞菌对其它抗生素类的耐药性

3 讨论

维氏气单胞菌广泛分布于淡水、淤泥和污水等环境中，通常在水体养殖环境恶化和鱼体体质较弱时，对多种养殖鱼类具有不同程度的致病性，防控不及时或用药不当时可造成养殖鱼类的大面积死亡［4，8，9］，因此，针对不同分离源维氏气单胞菌开展菌株耐药性分析对于有效防控该菌感染病例具有十分重要的指导意义。研究表明，不同动物源的维氏气单胞菌存在生物特性差异，对抗生素的耐药性也存在差异［10］，而相同菌株对不同抗生素的抗菌后效应也存在差异［11］。本实验对109株草鱼源维氏气单胞菌的耐药性研究也获得相似的结果，即不同年份不同地区的维氏气单胞菌分离株对抗生素的耐药性表现均存在一定程度的差异，然而可喜的是，包括供试维氏气单胞菌对氟苯尼考、甲砜霉素、环丙沙星、诺氟沙星、强力霉素等抗生素在内的多种仍具有极高的敏感性。

本试验中，来自不同分离区域的草鱼源维氏气单胞菌已经出现多重耐药的现象，其中菌株对β-内酰胺类的新生霉素、氨苄西林和头孢拉定的耐药性最为严重，其耐药率均在80%以上，虽然超过13.8%的菌株对头孢拉定敏感，但是菌株对该药的耐药率也达到77%；而供试菌株对大环内酯类药物中的麦迪霉素和克拉霉素的耐药率也超过70%。这表明，用于本试验的β-内酰胺类药物和大环内酯类药物对供试维氏气单胞菌的体外抑菌效果并不理想。据报道，革兰氏阴性菌对β-内酰胺类药物和大环内酯类药物的耐药性与菌株染色体或质粒上携带的耐药基因有关［12］。在耐药基因的介导下，菌株分泌的β-内酰胺酶类与β-内酰胺类的内酰胺活性基团共价结合后使其发生水解，导致药物失效［13-14］；而细菌通过产生钝化酶使药物大环内酯结构发生水解或通过产生甲基化酶使位于菌株核糖体50S亚单位的23S RNA的腺嘌呤甲基化，导致抗菌药物不能与活性部位结合而失效［15］。因此，在本试验基础上，下一步工作针对109株供试维氏气单胞菌的耐药基因进行检测与分析，将有利于在基因水平上的分析结果与本试验结果进行比较联系，也有利于阐明维氏气单胞菌对这两类药在基因水平上的耐药机制。

本试验中，我们发现两种有趣的现象，一是不同地区分离的维氏气单胞菌对同一种抗生素的耐药程度是存在差异，如从洪湖、安乡和汉寿等地区分离到的菌株对红霉素、链霉素、庆大霉素、丁胺卡那霉素等的耐药性均存在着差异；二是相同地区分离的维氏气单胞菌对同一种抗生素的耐药性也有差异，如在不同时间从洪湖地区分离到的菌株对甲砜霉素、氟苯尼考、诺氟沙星、强力霉素、环丙沙星和磺胺嘧啶的耐药性表现也存在差异，但这种差异只属于个别的现象。有学者认为，以上这两种现象与养殖地区长期使用单一药物、给药途径、用药剂量以及耐药菌株通过各种媒介传播等因素密切相关［16-17］。从表4～6可知，多数供试菌株对氟苯尼考、甲砜霉素、环丙沙星和强力霉素等药物具有良好的敏感性，敏感率都在75%以上，这表明，以上这几种抗生素对维氏气单胞菌的体外抑菌效果很好，而菌株对这几种药物的耐药现象也不普遍。供试维氏气单胞菌对红霉素和多粘菌素等药物介于耐药和敏感之间的比例分别为59.6%和40.5%，而对包括妥布霉素和卡那霉素在内的多种抗生素介于耐药和敏感之间的比例已超过35%，这种现象应该引起重视，如果生产上在药物的给药途径、用药剂量、药物配伍等方面能够得到有效规范，及时清理感染死亡鱼避免病原扩散，是可以减缓这部分介于耐药和敏感的菌株趋向耐药性或完全耐药性的过程的。

从本研究团队近年来对我国草鱼主要养殖区的病原菌流行病学监测结果来看，维氏气单胞菌在草鱼发病病例中阳性检出率越来越高，既有单发性感染，也有并发感染，所引起草鱼发病症状表现包括赤皮、肠炎、烂尾和烂鳃等，导致生产终端难以根据有效的鉴别方法对维氏气单胞菌感染病例做出比较可靠的诊断，有时往往也因此延误了病情。因此，我们建议在选择维氏气单胞菌感染症的治疗药物时，条件允许的情况下应先进行规范的药敏试验筛选敏感药物，同时结合药物的种类和特性，确定药物的有效给药途径和使用剂量，如将药物拌饲投喂时，可考虑同时配合使用适量的粘合剂［18］，以减少药物在水中溶散而导致感染鱼采食时摄入的药物剂量未能达到有效抑制或杀灭病原菌的作用，尤其是对于选用水溶性抗生素类药物进行治疗时更应该注意了。在防治维氏气单胞菌病并发感染其他细菌时，可采用联合用药的方式进行，但应注意抗生素的配伍禁忌以及交替用药［19］，以确保选用的药物能发挥更好的疗效。

［1］杨正时.气单胞菌属分类学研究进展［J］.中国人兽共患病杂志,1990,6（1）:49-52.

［2］房海,陈翠珍,张晓君,等.中华绒螯蟹病原维氏气单胞菌的检验［J］.中国人兽共患病学报,2008,24（1）:45-49.

［3］林启存,蔡丽娟,杨仲景.丁鱥溃疡病的病原菌分离、鉴定与人工感染试验［J］.水产科学,2005,24（11）:21-22.

［4］汪开毓,陆艳,耿毅,等.维里纳气单胞菌致泥鳅溃疡病的病理学观察［J］.水利渔业,2008,28（4）:117-120.

［5］李本旺,李春枝,张邦杰,等.中华鳖口咽腔溃烂综合症病原的研究［J］.水产科技情报,2000,27（5）:210-213.

［6］黄小丽,汪开毓.斑点叉尾鮰维氏气单胞菌病的诊断与防治［J］.水产科技情报,2009,36（5）:240-241.

［7］张海月,康元环,孙武文,等.乌鳢源维氏气单胞菌胞外产物的生物学活性分析［J］.中国兽药杂志,2016,50（10）:6-9.

［8］RAHMAN M,COLQUE-NAVARRO P,KUHN I,et al.Identification and characterization of pathogenic Aeromonas veronii biovar sobria associated with epizootic ulcerative syndrome in fish in Bangladesh［J］.Appl Environ Microbiol,2002,68（2）: 650-655.

［9］黄文明,王利,冀国桢，等.胭脂鱼维氏气单胞菌和中间气单胞菌的鉴定及药物敏感性［J］.水产科学,2013,32（4）: 210-214.

［10］单晓枫,康元环,夏京津,等.不同动物源性维氏气单胞菌生物学特性比较研究［J］.中国兽医杂志,2015,51（3）: 82-85.

［11］张路,徐洋,潘晓艺，等.5种喹诺酮类药物对维氏气单胞茵体外抗生素后效应的研究［J］.中国预防兽医学报,2015, 37（2）:106-109.

［12］李远志,白晓梅,贺智英.细菌的耐药机制［J］.延安大学学报（医学科学版）,2007,5（1）:6-7.

［13］LIVERMORE D M.Beta-lactamase-mediated resistance and opportunities for its control［J］.Journal of Antimicrobial Chemotherapy,1998,41（4）:25-41.

［14］MOOSDEENF.The evolution ofresistance tocephalosporins［J］.Clinical Infectious Diseases,1997,24（3）:487-493.

［15］王睿,柴栋.细菌耐药机制与临床治疗对策［J］.抗生素分册,2003,24（3）:97-103.

［16］林璐明,苏跃朋.水产抗生素类药物的耐药性机制及合理应用［J］.河北渔业,2009（5）:42-43.

［17］张日亮,牛立国,王淑华.谈水产养殖病原体形成耐药性的原因、后果及对策［J］.黑龙江水产,2007（4）:47-48.

［18］聂国兴,王俊丽.鱼用非营养性添加剂的研究与应用［J］.科学养鱼,2000（7）:40-41.

［19］童军.水产养殖中病原生物的耐药性及其防止对策［J］.水产养殖,1992（2）:22-24.

【责任编辑：邓军文 dengjunwen69@126.com】

The resistance to antibiotics of 109 Aeromonas veronii isolated from Ctenopharyngodon idellus

HUANGJin-lu1,TANXiao-chen1,PENGShu-hua1,ZENGYu-kun1,LINDe-jie1
（Animal Husbandryand Fisheries Research Center ofGuangdongHaid Group Co.,Limited,Guangzhou 511400,China）

Basing on the agar diffusion method,the resistance of 109 Aeromonas veronii isolated from Ctenopharyngodon idellus to twenty five antibiotics was analyzed.As the result showed,over 89 percent A. veronii isolations were resistant to Penicillin and Novobiocin.Also over 70 percent A.veronii isolations were insensitive to Midecamycin,Kitasamycin and Clarithromycin.However,many A.veronii isolations were well sensitive to Tetracycline,Norfloxacin and Streptomycin.Over 80 percent of A.veronii isolations were sensitive and hypersensitive toFlorfenicol,Azithromycin,and Norfloxacin Ciprofloxacin Thiamphenicol.

Aeromonas veronii;Ctenopharyngodon idellus;antibiotic;resistance

S943

A

1008-0171（2017）02-0066-06

2017-02-21

黄锦炉（1982-），男，广东揭阳人，广东海大集团股份有限公司博士。