金荞麦药酒对佐剂性关节炎大鼠氧自由基和免疫功能的影响

潘朝旺，王 伟，万进军（.鄂州职业大学医学院药学系，湖北 鄂州 436009；.鄂州市中心医院药学部，湖北 鄂州 436009）

金荞麦药酒对佐剂性关节炎大鼠氧自由基和免疫功能的影响

潘朝旺1，王 伟2，万进军1
（1.鄂州职业大学医学院药学系，湖北 鄂州 436009；2.鄂州市中心医院药学部，湖北 鄂州 436009）

目的 研究金荞麦药酒对佐剂性关节炎模型大鼠的治疗效果，探讨其作用机制。方法 将大鼠随机分为正常组、模型组、阳性对照组（每天灌胃雷公藤多苷片混悬液0.03 g/kg），低、中、高剂量金荞麦组（每天灌胃金荞麦药酒0.54、1.08、2.16 g/kg）。建立佐剂性关节炎模型12 d后给药21 d，观察大鼠左后足跖肿胀体积，检测血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和足跖软组织TNF-α、前列腺素E2（PGE2）、一氧化氮（NO）含量；流式细胞术分析脾脏淋巴细胞凋亡率，免疫组化法检测膝关节滑膜巨噬细胞密度。结果 与正常组比较，模型组足跖肿胀体积、血清TNF-α、MDA和足跖软组织TNF-α、PGE2、NO水平、膝关节滑膜巨噬细胞密度明显升高（P＜0.01），血清SOD、脾脏淋巴细胞凋亡率明显降低（P＜0.01）。与模型组比较，金荞麦可明显降低足跖肿胀体积、TNF-α、PGE2、NO水平和膝关节滑膜巨噬细胞密度，升高脾脏淋巴细胞凋亡率（P＜0.05或P＜0.01），但SOD、MDA无明显变化（P＞0.05）。结论 金荞麦药酒治疗类风湿关节炎的机制可能与调节TNF-α、PGE2、NO水平、膝关节滑膜巨噬细胞密度、脾脏淋巴细胞凋亡率有关。

佐剂性关节炎；金荞麦药酒；氧自由基；免疫功能；流式细胞术

类风湿关节炎（rheumatic arthritis,RA）是一种以关节滑膜炎和关节外病变为主要临床表现的自身免疫性疾病，可导致关节破坏、畸形和残疾。金荞麦具有祛风湿、润肺补肾等功效，在民间，有RA患者将金荞麦泡成药酒服用，效果明显。本实验旨在研究金荞麦药酒对佐剂性关节炎模型大鼠血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和足跖软组织TNF-α、前列腺素E2 （PGE2）、一氧化氮（NO）含量、脾脏淋巴细胞凋亡率及膝关节滑膜巨噬细胞密度的影响，探讨其抗RA作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

8周龄SD大鼠80只，雌雄各半，体质量（200± 20）g，SPF级，由三峡大学实验动物中心提供，使用许可证号：SYXK(鄂)2011-0012。

1.2 药品与试剂

金荞麦药酒，鄂州职业大学医学院制备，乙醇浓度为42.3%，每毫升药酒相当于金荞麦原药材0.4 g，该药酒在民间的成人剂量为每天约6 g（以原生药计），相当于本药酒15 mL；SOD、MDA、考马斯亮蓝试剂盒 （批号：20150315），TNF-α、PGE2 ELISA试剂盒（批号：20150327），上海拜力生物科技有限公司；ANNEXIN V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（批号：20150309），天津百浩生物科技有限公司；ED1单抗（标记巨噬细胞），AEC显色试剂盒（批号：20150322），武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 仪器

COULTEREPICSXL流式细胞仪，美国；PV-200型足容积测定仪，成都泰盟科技有限公司；9602A酶标仪，南京普朗医用设备有限公司；UV754紫外可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司；HS2046病理切片机，金华市华速科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 动物造模及分组给药 采用随机数字表法抽取大鼠10只，为正常组，其余70只建立佐剂性关节炎模型[1]，在无菌条件下向每只大鼠左右后肢足跖部注射完全弗氏佐剂0.1 mL，12 d后，观察造模大鼠，同正常组相比，食量减少，体质量增长缓慢，精神不振，两侧后踝关节出现明显肿胀，行动不便，说明造模成功。挑选造模成功的大鼠50只随机分为5组，即模型组，阳性对照组，金荞麦低、中、高剂量组。每天灌胃雷公藤多苷片混悬液0.03 g/kg（相当于成人剂量3倍，该药成人剂量为每天0.11 g）给予阳性对照组，低、中、高剂量金荞麦组每天灌胃不同浓度金荞麦药酒0.54、1.08、2.16 g/kg（相当于成人剂量1、2、4倍），正常组、模型组每天灌胃生理盐水10 mL/kg。均连续给药21 d。

1.4.2 足跖肿胀体积测定 观察并记录致炎后第12、18、25、32天各组大鼠左后足跖肿胀体积。参照文献[2]采用排水容积法测定大鼠足趾和关节的容积。

1.4.3 测定血清TNF-α、SOD、MDA 末次给药2 h后，处死大鼠，取血 5 mL，3 500 r/min离心10 min，离心半径6 cm，取上清液按试剂盒说明测定血清中TNF-α、SOD、MDA水平。

1.4.4 足跖软组织PGE2、NO、TNF-α检测 剪下左后足掌，取足跖软组织100～200 mg，剪碎，放入匀浆器，加9倍生理盐水制备匀浆，离心10 min，取上清液按试剂盒说明测定PGE2、NO、TNF-α含量。

1.4.5 检测脾脏淋巴细胞凋亡 按文献方法[3]，取大鼠脾脏，称质量，生理盐水冲洗，加磷酸盐缓冲液研磨，过100目筛，1 000 r/min离心10 min，弃掉上清液，向沉淀中加适量红细胞裂解液，静置5～6 min，再1 000 r/min离心10 min，用加入10%胎牛血清1 640完全培养液重悬细胞，调整细胞浓度2×106个/mL，取上述液体0.1 mL按ANNEXIN V-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书操作，流式细胞仪检测分析。

1.4.6 膝关节滑膜ED1免疫组化染色及巨噬细胞计数 取大鼠右后肢膝关节，暴露膝关节，用手术剪沿髌骨周围将整块滑膜剪成条状，固定，石蜡包埋切片，SP染色法进行ED1免疫组化染色，AEC显色，显微镜下观察滑膜衬里层ED1阳性细胞分布密度(细胞数/mm2滑膜)。

1.5 数据统计

数据用SPSS 17.0软件进行统计处理，各实验组数据均采用“±s”表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较用T检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对足跖肿胀体积的影响

造模12 d后，与正常组比较，模型组肿胀明显（P＜0.01），提示造模成功；造模18、25、32 d后，除金荞麦低剂量组外，各给药组与模型组比较，足跖肿胀体积明显下降（P＜0.05或P＜0.01）。阳性对照组、金荞麦中、高剂量组从造模25 d开始，与造模12 d比较，足跖肿胀体积明显下降（P＜0.05或P＜0.01）。见表1。

表1 金荞麦药酒对大鼠足跖肿胀体积的影响 （±s，n=10）

表1 金荞麦药酒对大鼠足跖肿胀体积的影响 （±s，n=10）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与造模12 d比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

2.2 对血清TNF-α、SOD、MDA的影响

与正常组比较，模型组TNF-α、MDA水平明显升高（P＜0.01）,SOD水平明显降低（P＜0.01）；与模型组TNF-α比较，阳性对照组和金荞麦高、中剂量组明显下调（P＜0.01），金荞麦低剂量组下调不明显；与模型组SOD、MDA比较，各给药组无明显差异。见表2。

表2 金荞麦药酒对大鼠血清TNF-α、SOD、MDA的影响（±s，n=10）

表2 金荞麦药酒对大鼠血清TNF-α、SOD、MDA的影响（±s，n=10）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别正常组模型组阳性对照组金荞麦低剂量组金荞麦中剂量组金荞麦高剂量组TNF-α(pg/mL) 265.5±79.50** 394.3±121.1 285.4±95.42** 359.3±119.6 307.9±86.45** 288.7±86.22** SOD (U/mg) 208.7±13.48** 137.3±12.65 122.4±13.83 126.9±13.71 133.1±16.35 124.3±15.62 MDA （nmol/mg）14.54±0.54** 21.44±0.98 21.93±0.87 20.51±0.84 22.22±0.91 21.22±0.76

2.3 对足跖软组织PGE2、NO、TNF-α的影响

与正常组比较，模型组PGE2、NO、TNF-α明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，除金荞麦低剂量组外，阳性对照组和金荞麦高、中剂量组PGE2、NO、TNF-α明显下降（P＜0.01或P＜0.05）。见表3。

表3 金荞麦药酒对大鼠足跖软组织PGE2、NO、TNF-α的影响 （±s，n=10）

表3 金荞麦药酒对大鼠足跖软组织PGE2、NO、TNF-α的影响 （±s，n=10）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

) * * *

2.4 对大鼠脾脏淋巴细胞凋亡的影响

与正常组比较，模型组脾淋巴细胞凋亡率明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，各剂量金荞麦组和阳性对照组脾淋巴细胞凋亡率明显升高（P＜0.05或P＜0.01）。见表4。

2.5 对大鼠膝关节滑膜巨噬细胞的影响

与正常组比较，模型组巨噬细胞密度明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，各剂量金荞麦组和阳性对照组巨噬细胞密度明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。见表4。

表4 金荞麦药酒对大鼠脾脏淋巴细胞凋亡、膝关节滑膜巨噬细胞的影响 （±s，n=10）

表4 金荞麦药酒对大鼠脾脏淋巴细胞凋亡、膝关节滑膜巨噬细胞的影响 （±s，n=10）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 剂量（g/kg）正常组模型组阳性对照组金荞麦低剂量组金荞麦中剂量组金荞麦高剂量组生理盐水生理盐水0.03 0.56 1.08 2.06脾淋巴细胞凋亡率(%) 22.85±4.13** 16.52±2.21 20.98±1.94** 19.15±2.02* 19.49±1.64* 21.13±2.24**巨噬细胞（个/mm2）7.30±3.40** 75.3±36.4 25.1±12.3** 42.3±21.3* 35.2±19.6* 23.5±11.2**

3 讨论

常用RA动物模型较多[4]，本研究采用的是佐剂性关节炎动物模型。佐剂性关节炎大鼠病理变化与人体RA相似，是较公认的免疫性关节炎模型。

以TNF-α为代表的炎性因子在RA发病中占重要地位，在RA活动期或进展期呈高RNA的表达，而提高Bmal1和Cry1的表达[5-6]。另外，RA血管翳的形成与TNF-α有关，在滑膜组织细胞，TNF-α可刺激滑膜组织滑膜细胞核软骨细胞中 IL-6、PGE2、胶原酶和基质金属蛋白酶的合成，促进生长因子释放，引起RA患者免疫功能紊乱，局部炎症反应加剧，骨与软骨基质不可逆破坏，以及血管翳形成；同时使破骨细胞减少糖蛋白合成，增加糖蛋白降解，并产生胶原酶和其他中性蛋白酶，释放骨钙等，从而导致骨和软骨破坏。此外，TNF-α作为促炎因子可激活内皮细胞、单核-巨噬细胞、T细胞并产生趋化因子，诱导和募集更多的炎性细胞浸润，通过多环节、多途径引起局部关节骨与软骨炎症破坏。抗TNF-α单抗目前已经应用于治疗RA患者，效果良好。研究表明[7]，发生RA患者外周血中TNF-α水平明显高于正常人，有望成为RA活动的评价指标之一。

RA患者体内SOD水平明显低于健康人，SOD 与MDA是相互对立的氧自由基相关因子，SOD具有清除体内氧自由基的作用，消除炎症，保护关节免受伤害，而MDA作用刚好相反。当机体SOD浓度偏低时,MDA会升高，过量的超氧阴离子就会引起疾病。本研究表明，模型组大鼠血清SOD水平明显低于正常组，MDA明显高于正常组；但各给药组包括阳性对照组与模型组比较，血清SOD和MDA没有明显差异，提示金荞麦药酒不是通过影响SOD和MDA来实现治疗RA的，因此，寻找和选择相关的阳性药物将是我们的后续研究任务之一。

NO是生物体内反应性极强的自由基，可通过精氨酸依赖的途径由活化的巨噬细胞合成和分泌，是一种效应分子，兼有第二信使和神经递质作用，具有广泛的生理作用。NO对免疫系统有双重作用,低水平时能够参与免疫应答的信息传递,而高水平时可引起细胞毒性作用，造成组织损伤，导致关节发生不同程度的病变。NO可促进巨噬细胞合成释放IL-1、TNF-α等细胞因子,导致滑膜及炎性细胞产生和释放前列腺素增多。已经有研究表明，RA患者NO水平明显高于正常人，并且可能参与了RA的病变过程，与本实验的结果基本相符。

PGE2是花生四烯酸的代谢产物之一，也是机体组织中普遍存在的炎症介质之一，在RA病理过程中起着非常重要的作用。PGE2可促进类风湿滑膜成纤维细胞的分裂增殖,促成微血管新生；另外，PGE2作为炎性因子，使血管通透性增加，引起组织水肿，在滑膜炎和血管翳的形成过程中全程参与，通过使用选择性COX－2抑制剂、减少PGE2生成抗炎药已经成为治疗RA的常规用药之一[8-9]。

在RA患者病变关节滑膜内，多种细胞出现异常增殖或凋亡[10]，其中巨噬细胞数量明显增多。其不仅与关节疼痛数、压痛数、血沉、C反应蛋白等反映RA病情程度的指标呈明显的正相关,还与X线关节破坏的侵蚀积分和狭窄积分呈明显的正相关，可能与其释放TNF-α、IL-1、IL-6等炎性因子有关，这些炎性因子在触发滑膜细胞激活导致关节受损和诱导炎症过程中起重要作用[11]。本实验同时显示，RA大鼠脾淋巴细胞凋亡率较正常大鼠明显降低，可能与RA是一种免疫性疾病有关，其机制有待进一步研究。

综上所述，金荞麦药酒可降低佐剂性关节炎大鼠足跖肿胀体积，降低血清TNF-α和足跖软组织TNF-α、PGE2、NO水平，调节膝关节滑膜巨噬细胞密度和脾脏淋巴细胞凋亡率，为其用于RA的治疗提供了实验依据。

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（本文编辑 杨 瑛）

Effects of Fagopyrum Dibotrys Medicinal Liquor on Oxygen Free Radicals and Immune Function in Adjuvant Arthritis Rats

PAN Chaowang1，WANG Wei2，WAN Jinjun1
（1.Ezhou Polytechnic,Ezhou,Hubei 436009,China；2.Ezhou Central Hospital,Ezhou,Hubei 436009,China）

Objective To study the therapeutic effects of Fagopyrum dibotrys medicinal liquor on adjuvant arthritis rats, and to explore the machanism.Methods The rats were randomly divided into the normal group,model group,positive controlgroup (with oraltripterygium glycosides 0.03 g/kg every day),low,middle and high dose group offagopyrum dibotrys medicinal liquor.After 12 days of buliding adjuvant arthritis rat models,the rats were administrated for 21 d. The left hind paw swelling volume were observed，and serum TNF-α，SOD，MDA and plantar soft tissue TNF-α，PGE2，NO were measured.The lymphocyte apoptosis rate was detected by flow cytometry and the synovium macrophages density of kneejoint were also detected by immunohistochemical method.Results Compared with the normal group,the left hind paw swelling volume,serum TNF-α，MDA and plantar soft tissue TNF-α，PGE2，NO，synovium macrophages density of knee-joint significantly increased in model group（P＜0.01）.But the serum SOD and the lymphocyte apoptosis rate significantly decreased (P＜0.01).Compared with the model group,the left hind paw swelling volume,TNF-α，PGE2，NO and synovium macrophages density of knee-joint significantly decreased and the lymphocyte apoptosis rate significantly increased in Fagopyrum dibotrys medicinal liquor group(P＜0.05 or P＜0.01),but SOD and MDA had no obvious changes(P＞0.05).Conclusion The mechanism of fagopyrum dibotrys medicinal liquor for rheumatoid arthritis maybe related to adjust the TNF-α,PGE2,NO,lymphocyte apoptosis rate and synovium macrophages density of knee-joint.

adjuvant arthritis;Fagopyrum dibotrys medicinal liquor;oxygen free radicals；immune function;flow cytometry

R285.5；R593.21

B

doi:10.3969/j.issn.1674-070X.2017.04.004

2016-07-21

湖北省教育厅科学技术研究项目（B2014176）。

潘朝旺，男，副教授，主要从事中药药理研究，E-mail:455128707@qq.com。

本文引用：潘朝旺，王 伟，万进军.金荞麦药酒对佐剂性关节炎大鼠氧自由基和免疫功能的影响[J].湖南中医药大学学报，2017，37（4）：361-364.