利用RNAi技术控制害虫

闸雯俊+李三和+周雷+刘凯+陈志军，杨国才，刘++凯+徐华山+李培德+游艾青

摘要：RNAi能够抑制基因特异序列的表达，为昆虫学的研究提供了新方法，尤其是可以分析基因的功能，控制害虫种群以及减少疾病病原体的感染。昆虫RNAi的相关文献发现不同的种群、RNAi的摄入方式、靶标基因都会影响RNAi的效率，这也是转录本抑制程度存在差异的原因所在。对于那些不能稳定转基因的物种，如昆虫，利用dsRNA介导的RNAi技术是快速分析基因功能的重要手段。

关键词：RNAi；害虫控制；dsRNA

中图分类号：S476.9 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）06-1006-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.06.002

Abstract： RNA interference（RNAi）， the sequence-specific suppression of gene expression， offers great opportunities for insect science， especially to analyze gene function， manage pest populations， and reduce disease pathogens. The accumulating body of literature on insect RNAi has revealed that the efficiency of RNAi varies between different species， the mode of RNAi delivery， and the genes being targeted. There is also variation in the duration of transcript suppression. Double-stranded RNA（dsRNA） mediated RNAi has emerged as one of the most powerful strategies for the rapid analysis of gene function，particularly in organisms for which stable transgenesis is not available，such as insects.

Key words： RNAi； insect pest control； dsRNA

RNA干扰（RNA interference，RNAi）已经彻底改变了昆虫学研究的范围，因为它使研究者能够抑制目的基因的表达，从而将改变的表型和基因功能联系起来。对于基础研究而言，RNAi为所有的昆虫基因组学研究提供了一条路径，同时对应用昆虫学也有巨大的潜在作用。例如，RNAi能够通过抑制关键基因提高死亡率来控制害虫。此外，利用无害的病毒序列来启动抗病毒RNAi反应，能够有效防止益虫（如蜜蜂和家蚕）感染高致病性病毒。

1 RNAi的机制

RNAi是利用非编码的小RNA分子切割靶标mRNA来抑制基因的表达。主要分为以下3个阶段。

1）起始阶段。核糖核酸酶Ⅲ型家族的核酸酶Dicer，以ATP依赖的方式，逐步切割加工导入生物体的外源或内源性转录生成的dsRNA，生成21～23 nt的siRNA（small interfering RNA），其与靶标mRNA具有高度特异性，为成功降解提供保证。

2）效应阶段。siRNA双链结合其他蛋白复合物形成RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex RISC），雙链siRNA解链，RISC介导单链反义siRNA通过碱基配对原则从siRNA引导链中心所对应的靶基因位置切割靶mRNA，进一步降解mRNA，同时还可以引发宿主细胞的一系列反应。

3）放大效应阶段。siRNA在引导RISC切割靶RNA的同时，也在RNA聚合酶（RdRP）的作用下以mRNA为模板合成新的dsRNA。紧接着进入第一阶段循环过程生成大量次级的siRNA，经过逐级放大效应，使mRNA彻底降解。

2 利用RNAi控制害虫群体

利用RNAi技术控制害虫和保护驯化的益虫（例如蜜蜂）已经得到广泛应用。一般情况下，RNAi序列适用于任何形式，从单个基因型到家系甚至昆虫所属的目。

2.1 利用RNAi控制害虫

利用RNAi控制害虫最早应用于玉米根虫[1]和棉铃虫[2]。研究者喂养玉米根虫含有290条dsRNAs的人工饲料，其中发现14个基因会使成虫的生理活动下降，并且对液泡ATP酶亚基A基因（V-ATPase）进行了详细的分析。人工饲料中只含有低浓度的V-ATPase的dsRNAs，经玉米根虫取食后，相应的mRNA也会受到抑制。更重要的是，研究者将玉米根虫喂养在表达V-ATPase dsRNAs的转基因玉米上后，发现根虫的V-ATPase基因表达量下降，玉米根部受损程度降低。研究者发现棉铃虫有一个靶标基因细胞色素P450（CYP6AE1），该基因在幼虫中肠中表达，对棉花的二级次生代谢产物棉子酚具有解毒功能。当将棉铃虫喂养在表达CYP6AE14-dsRNA的转基因拟南芥和烟草上时，该基因在虫体中肠里的表达量下降，幼虫生长发育减速[3]。同时玉米根虫和棉铃虫也都有了新的研究发现。其中Snf7基因主要参与膜受体的运输，在玉米根虫中的效果非常显著[4]。同时在棉花中表达半胱氨酸蛋白酶后，棉铃虫取食转基因植株后，虫体围食膜的功能减弱，变得更容易吸收dsRNA。更重要的是，棉花同时表达dsCYP6AE14和半胱氨酸蛋白酶比单一表达其中一个基因的抗性要强[5]。

上述研究阐明了利用RNAi控制害虫有两个关键因素：①用于RNAi靶标基因序列的选择。②传递dsRNA的方式。其中靶标基因必须是昆虫的关键基因，同时在昆虫的整个生活史中要持续表达。随着技术从理论证明到应用的转变，严苛设计靶标序列是必须的。先决条件就是从dsRNA中获得的21～25 bp siRNAs必须与序列保证完全的一致性，同时还要与昆虫的mRNA具有同源性。并且还要与非靶标物种的所有siRNAs和编码蛋白基因具有序列差异性。这些比对都可以在网上进行，将候选的dsRNA同时与靶标物种的目的基因及所有公共基因组中预测的编码蛋白的基因进行比对。要杜绝不能与靶标序列完全匹配的siRNAs以及与非靶标物种序列匹配的siRNAs。