阿司匹林对人宫颈癌Hela细胞BCL—6mRNA表达的影响

张洁+石小风+谌新兴+贾静

【摘要】目的：研究阿司匹林对人宫颈癌Hela细胞增殖及BCL-6 mRNA 表达量的影响。方法：不同剂量的阿司匹林干预人宫颈癌 Hela细胞24h后，用MTS法观察其对人宫颈癌 Hela细胞增殖状态的影响及采用逆转录-聚合酶链反应（qRT-PCR） 检测阿司匹林作用后 Hela 细胞 BCL-6 mRNA 量的变化。结果：阿司匹林能抑制Hela细胞增殖及促进细胞中 BCL-6 mRNA 的表达，且促进强度随阿司匹林的浓度的增加而增加。结论：阿司匹林能够抑制人宫颈癌Hela细胞的生长，并从 mRNA 水平促进 BCL-6 蛋白的表达。

【关键词】 阿司匹林；人宫颈癌 Hela 细胞；BCL-6

【中图分类号】R73-36+1【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2017）05-0049-03

阿司匹林属于非甾体抗炎药的代表药，是临床上常用的解热镇痛药。研究发现长期低剂量服用阿司匹林具有预防肿瘤的作用[1]，对肠癌细胞系、乳腺癌、胰岛瘤NIT-1细胞、宫颈癌Hela细胞等均有抑制作用[2-4]。宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，其全球发病率位居女性恶性肿瘤中第2位[5]。其发病是一个多因素、多步骤级连的过程[6]，发病机制尚未完全阐明。BCL-6基因（B cell lymphoma 6，简称 BCL-6）是Ye等[7]在 1993年研究非霍奇金淋巴瘤免疫基因图谱时发现的一种原癌基因。在生理条件下，BCL-6 主要表达于生发中心 B 细胞和 CD4T 细胞，调节B细胞活化及分化相关基因如 blimp-1、CD4等[8]、细胞周期调控基因如p27kip1、cyclinD2、炎症有关的趋化因子基因如MIP-1a 和 IP-10[9]的表达。大量研究发现[10-12]发现BCL-6 在多种肿瘤中表达量增加，并且与肿瘤的增殖、侵袭和迁移密切相关。由于BCL-6与肿瘤密切相关，所以我们推测阿司匹林可能通过促进BCL-6的转录表达来抑制宫颈癌Hela细胞的增殖。本研究通过观察阿司匹林对人宫颈癌 Hela 细胞 BCL-6 mRNA 表达的影响来探究宫颈癌的发病机制。

1仪器与材料

11细胞人宫颈癌 Hela 细胞株，购于武汉博士德生物工程有限公司。

12试剂和药品RPMI-1640培养基（Gibco公司）；青霉素-链霉素混合溶液（100×双抗，Gibco公司）；胎牛血清 （FBS，Gibco公司）；二甲基亚砜 （DMSO，Sigma公司）； 0 02% EDTA/0 25% 胰蛋白酶（Gibco公司）；Trizol （Invitrogen公司）；CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay（promega公司）；GoTaq 2-Step RT-qPCR System （Promaga公司）；其它试剂均为国产分析纯。

13仪器二氧化碳培养箱（美国thermo公司）；BX51倒置显微镜（日本奥林巴斯公司）； NanoDrop 2000超微量分光光度计（美国赛默飞世尔科技公司）；T100 Thermal Cycler PCR仪（美国Bio-Rad公司）；Eco荧光定量PCR系统（美国Illumina公司）。

14药物Aspirin（货号：A2093，SIGMA公司）。

2方法

21阿司匹林溶液的配制与人宫颈癌 Hela 细胞培养

211阿司匹林溶液的配制将40mL完全培养基放至 50mL的离心管中备用；再用电子天平准确称取72064g的阿司匹林粉末（分子量为 18016），溶于准备好的 40mL完全血清培养基中，用震荡混匀器充震荡使其完全溶解，再将pH值调至 71～72，即得 1mol/L 的阿司匹林母液，随后转移至超净台用 022μm 的微孔过滤器过滤除菌，分装至小离心管中，置于-20℃冰箱保存，使用时予完全培养基稀释至不同浓度的阿司匹林25、50、100、200mmol/L。

212人宫颈癌 Hela 细胞培养人宫颈癌 Hela细胞于37℃、饱和湿度、 5% CO2条件下贴壁培养，经025%的胰蛋白酶常规消化后按一定量接种至RPMI-1640培养基（含10% FBS，1%双抗）中吹散均匀，移入新细胞培养皿，于培养箱中继续培养，每3～4d传代1次，每日于倒置显微镜下观察细胞生长状况。

22MTS法检测不同浓度阿司匹林对HeLa细胞的生长抑制率取处于对数生长期的人宫颈癌 Hela细胞经025%的胰蛋白酶常规消化后按按1×104个/孔接种于96孔板内，每孔200μL，接种完毕后，将板置于37℃，含5% CO2的培养箱中贴壁过夜，24h 后，更换培养基为无血清培养基培养24h 后开始进行分组加药，空白组及对照组再分别加入200μL完全培养基，加药组分别加入不同浓度阿司匹林的完全培养基各200μL，每组设5个复孔，加药完毕继续于培养箱中培养；培养24h后，将板取出，每孔加入40μL MTS溶液，继续培养1～4h取出96孔板，用酶标仪测定490nm波长处的吸光度，实验重复3次。计算细胞的生长抑制率=（1-实验组OD值/对照组OD 值）×100%。

23qRT-PCR 检测阿司匹林对HeLa细胞中BCL-6 mRNA表达的影响 取处于对数生长期的细胞如前常规消化后按1×106个/孔接种于6孔板内，每孔2mL，接种完毕后，将板置于37℃，含 5%CO2的培养箱中贴壁过夜。次日，分别加药入不同浓度阿司匹林的完全培养基各2mL，对照组加入2mL完全培养基，加药完毕继续于培养箱中培养。取出细胞提取总RNA，NanoDrop 2000超微量分光光度计测定的RNA的浓度与纯度。按GoTaq 2-Step RT-qPCR System说明书进行逆转录（反应体系20μL，逆转录反应条件：25℃×10min，42℃×60min，70℃×15min，4℃×5min）以及qPCR（反应体系20μL，反应條件：扩增反应条件：95℃×2min，95℃×15sec，60℃×60sec，总共45个循环），实验重复3次。qPCR引物由北京市金瑞斯生物技术有限公司设计并合成，基因引物见表1。采用相对定量法（2-ΔΔCT法）计算目的mRNA相对表达量。

24统计学方法数据用 SPSS210统计软件进行统计，采用均数加减标准差（x±s）表示，单因素方差分析，P<005表示差异有统计学意义。

3结果

31阿司匹林对HeLa细胞生长抑制率的影响MTS结果显示，不同浓度的阿司匹林（25、50、100、200mmol/L）作用HeLa细胞24h后能抑制HeLa细胞的增殖，与对照组相比差异具有统计学意义（P<005），且呈剂量依赖性，即其抑制率随浓度的增大而逐渐增加。见图1、表2。

32阿司匹林对HeLa细胞中BCL-6 mRNA表达的影响qRT-PCR结果显示，不同浓度的阿司匹林（0、25、50、100、200mmol/L）作用HeLa細胞24h后能促进HeLa 细胞中BCL-6 mRNA表达，与对照组相比差异具有统计学意义（P<005），且呈剂量依赖性，即其促进程度随浓度的增大而逐渐增加。见图2。

4讨论

原癌基因BCL-6属于抗细胞凋亡家族，编码核转录抑制蛋白，在生发中心B细胞和具有生发中心B细胞表型的淋巴瘤中高表达。BCL-6的主要功能是转录抑制作用，受BCL-6调控的靶基因主要与细胞活化、分化和增生相关。研究发现BCL-6在多种肿瘤中有高表达，且与肿瘤的增殖、侵袭等密切相关[10-12]。BCL-6在弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤等淋巴瘤中显著高表达，且已成为弥漫大B细胞淋巴瘤的诊断标志物之一[13-14]。

宫颈癌是发生在全球妇女中仅次于乳腺癌的第二常见的恶性肿瘤。我国宫颈癌发病率已高居世界第二位，仅次于智利，且发病年轻化趋势明显，因此研究宫颈癌的发病机制、治疗、预防是一大热点。目前认为宫颈癌的发病主要与HPV感染引起机体内源性因素产生影响，如相关癌基因激活、抑癌基因失活、端粒酶活性高表达和机体免疫调节机制失衡等一系列病理改变，引起细胞增殖与凋亡调节异常，导致组织癌变。阿司匹林是非甾体抗炎药 （NSAIDs），可以通过抑制COX和NOS-2激活等途径来预防和抑制肿瘤的作用[15]。实验研究[16-18]也确实证明了阿司匹林能够抑制宫颈癌细胞的增殖与凋亡，但具体机制不详。

基于原癌基因BCL-6与宫颈癌发生发展的相关性，本项目组进行了此次实验，实验结果表明阿司匹林具有明确的抗宫颈癌的作用，并且该作用可能与其促进BCL-6的表达有关。其促进作用于阿司匹林的浓度呈正相关，但是阿司匹林是如何通过促进BCL-6表达来抑制宫颈癌的还需进一步的深入研究。

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