扶正解毒通络方对人肝癌HepG2细胞MMP-2、MMP-9表达及细胞侵袭作用的影响①

张景洲 冯相伟 孟繁平

(延边大学医学院免疫学与病原生物学教研室,延吉133002)

扶正解毒通络方对人肝癌HepG2细胞MMP-2、MMP-9表达及细胞侵袭作用的影响①

张景洲 冯相伟②孟繁平

(延边大学医学院免疫学与病原生物学教研室,延吉133002)

目的：探讨扶正解毒通络方对肝癌HepG2细胞侵袭作用和基质金属蛋白酶(Matrix metallo proteinases，MMP)-2、MMP-9表达水平的影响及可能的作用机制。 方法：CCK8实验检测扶正解毒通络方对HepG2细胞活性影响； Transwell侵袭实验检测扶正解毒通络方对HepG2侵袭能力的影响；ELISA法检测扶正解毒通络方干预HepG2细胞后 MMP-2和MMP-9的表达水平。结果：CCK8实验结果显示，扶正解毒通络方对HepG2细胞意志呈剂量时间相关性。Transwell 侵袭实验显示，2.65 mg/ml扶正解毒通络方对HepG2细胞侵袭力抑制率为52.45% (P<0.05)。ELISA检测结果显示，扶正解毒通络方干预后 HepG2 细胞上清液中MMP-2 和 MMP-9表达水平下降(P<0.05)。结论：扶正解毒通络方可以抑制肝癌HepG2细胞的生长和侵袭，其机制可能是通过下调MMP-2、MMP-9在肝癌细胞HepG2的表达。

扶正解毒通络方；肝癌HepG2细胞；MMP-2；MMP-9；细胞侵袭

肝癌是目前实体瘤中预后很差的恶性肿瘤之一。肝癌细胞具有较强的生长增殖、基质黏附和侵袭转移能力，这些都是影响肝癌预后的主要因素，因此寻找能抑制肝癌细胞增殖和侵袭的药物，成为人们进行抗肝癌药物研究的热点[1]。扶正解毒通络方是基于中医“毒损肝络”理论，方由姜黄、半边莲、半枝莲、虎杖、白术、茯苓等十味中药配伍而成，结合临床经验而制定经验方，用于肝癌的治疗，前期研究证实有较好的抗癌作用[2]。本文阐述扶正解毒通络方对肝癌HepG2细胞侵袭作用和MMP-2、MMP-9表达水平的影响，旨在为进一步阐述中药复方制剂抗肝癌的分子机制提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株及实验试剂 人肝癌HepG2细胞株购于美国赛默飞世尔公司，由本实验室传代培养；DMEM培养液、胎牛血清均购于美国赛默飞世尔公司；MMP-2 ELISA试剂盒、MMP-9 ELISA试剂盒购于美国Cloud-clone公司，Transwell小盒及基质胶购于美国BD公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 人肝癌HepG2细胞培养于含有10%FBS及1%双抗的DMEM培养液中。待其在37℃培养箱中培养至80%～90%融合时，进行细胞传代或铺板。

1.2．2 扶正解毒通络配方组成 取姜黄1 g、半边莲1 g、半枝莲1 g、虎杖1 g、白术1 g、茯苓1 g、黄芪2 g、当归0.667 g、鸡血藤1 g、桂枝0.667 g，放入离心管中；加30 ml双蒸水，煮沸1 h；离心，将上层药液转移到新的离心管中，再加入20 ml双蒸水将深沉重悬，再次煮沸1 h；将上层药液与第1次离心得到的上层药液合并；加热煮沸，将药液浓缩至30 ml。以毫克生药/每毫升水(mg/ml)进行计量。由此算得药物浓度为 10.334 g/30 ml=344 mg/ml；配制好的扶正解毒通络方，抽滤后4℃保存备用。

1.2.3 CCK8检测扶正解毒通络方对HepG2细胞活性的影响 取生长状态良好的HepG2细胞，调整细胞悬液密度为2×103cells/ml，96孔板中每孔加入100 μl 细胞悬液，将培养板置于培养箱中预培养24 h(37℃，5%CO2)。实验分为药物处理组和对照组，药物处理浓度为6、5、4、3、2、1、0 mg/ml。将培养板在培养箱中孵育适当的时间(如24、48、72 h)后，根据检测时间点，向每孔中加入10 μl CCK8培养液。将培养板在培养箱内孵育1.5 h。酶标仪测定在450nm处的吸光度。计算抑制率，以药物浓度为横坐标轴，抑制率为纵坐标轴作图并计算IC50。

1.2.4 Transwell检测细胞侵袭 采用带有8 μm微孔聚碳酸酯膜Transwell小室，在小室上铺50 μg胶；将HepG2 细胞使用2.65 mg/ml药物处理48 h后的，弃去旧培养基，用1×PBS洗一次，加0.25%胰酶消化，1 500 r/min离心5 min收集细胞；计数板下计数，调整细胞密度至7×105cells/ml，将每组细胞悬液取200 μl加入上室。下室加入细胞条件培养液共孵育24 h，每组三个平行样本；取出滤膜，用棉签擦尽上室面的细胞，4%多聚甲醛固定15 min；结晶紫染色后，1×PBS清洗3次，显微镜下观察拍照。

1.2.5 ELISA检测MMP-2、MMP-9含量 取适量包被的抗体/抗原与包被液混匀。在酶标板上加入稀释液100 μl/孔，4℃室温包被过夜；吸去包被液，每孔加入200 μl封闭液于37℃封闭2 h。封闭液是含3%BSA的PBS液；用PBST液洗涤3次，400 μl/孔；每孔加100 μl细胞上清液或者标准品，震荡混匀，置37℃室温孵育0.5～2 h。样品或标准品用PBS液稀释；用PBST液洗涤3次； 每孔加100 μl辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗猪IgG稀释液，置37℃室温孵育0.5～2 h。二抗用3% BSA的 PBS液稀释；用PBST液洗涤3次；每孔加TMB底物液100 μl，37℃室温显色5～15 min(底物液可以由10 ml显色剂B和0.4 ml显色剂A配制而成的，或者购买TMB底物液)；每孔加50 μl 1 mol/L HCl (2 mol/L 硫酸)的终止液来终止反应；用酶标仪测OD450值。

2 结果

2.1 CCK8筛选出最佳处理浓度和处理时间 经过3次24 h CCK8实验结果计算药物处理IC50值分别为2.8、2.4、2.75 mg/ml，我们取均值为2.65 mg/ml作为后续实验最佳处理浓度，以最佳浓度分别处理细胞24、48、72 h，结果24 h处理后细胞CCK8检测未见明显变化，处理72h后细胞死亡严重影响判读，故以48 h作为最佳药物处理时间(图1)。

2.2 扶正解毒通络方对HepG2细胞侵袭的影响 扶正解毒通络方作用于HepG2细胞后，进行Transwell实验，24 h后在10×10倍镜下随机选取3个视野进行拍照。经 2.65 mg/ml给药组(扶正解毒通络方)处理后，HepG2细胞的侵袭能力在扶正解毒通络方的作用下明显降低，HepG2 细胞穿膜细胞数(58.33±2.89)明显少于对照组穿膜细胞数(122.67±6.66),P<0.05，图2、3。给药组对HepG2细胞侵袭力抑制率达52.45%。

2.3 扶正解毒通络方对人肝癌HepG2中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9表达的影响 ELISA 检测

图1 CCK8检测扶正解毒通络方对HepG2细胞活性的影响Fig.1 Effect of Fuzhen Jiedu Tongluofang on HepG2 cell activity by CCK8

图2 扶正解毒通络方对HepG2细胞侵袭的影响Fig.2 Effect of Fuzheng Jiedu Tongluofang on invasion of human hepatoma HepG2 cells

图3 扶正解毒通络方对穿膜的细胞数量进行统计分析Fig.3 Effect of Fuzheng Jiedu Tongluofang on cell invasion of HepG2 cells

图4 扶正解毒通络方对HepG2细胞MMP2和MMP9表达量的影响Fig.4 Effect of Fuzheng Jiedu Tongluofang on expression of MMP-2 and MMP-9 of human hepatoma HepG2 cells

结果显示，应用2.65 mg/ml给药组 (扶正解毒通络方)作用于HepG2细胞48 h后 ，上清液中MMP-2及MMP-9表达水平明显下降，且差异均具有统计学意义(P<0.05，图4) 。

3 讨论

肝癌是世界癌症发病率第5位的常见肿瘤,并且在肿瘤相关性死亡危险因素中排名第3位,尤其是受肝炎病毒影响十分严重的亚洲和非洲地区[3]。肝癌难以早期发现，一旦出现临床症状，多为中晚期。中晚期肝癌来势猛，发展快，生存期短，西医药至今尚无较为理想的治疗方法，中医药在治疗中晚期肝癌时发挥着重要作用[4]。中草药来源广泛，在肝癌的防治方面有一定优势，因此国内外对于肝癌的中医药防治都有着迫切的需求[5]。

“毒损肝络”的基本理论基础认为毒邪作祟、阻滞于肝络，出现络虚、毒侵,而化毒为害则是络病迁延和深化的关键所在，此时疾病处于正虚邪实、病势胶着状态。其中，“毒”是启动因子，即“肝络之损”由“邪毒”启动，最终引起“肝络之变”(一是癌变，二是坏证之变)。“瘀”是其枢纽因子，是各种慢性肝病的中心环节，也是“肝炎一肝硬化一肝癌”三部曲的关键环节[6]。所以通络的基础上,兼以扶正解毒,故选用姜黄、半边莲、半枝莲、虎杖、白术、茯苓、黄芪、当归、鸡血藤、桂枝等中药，使血和气行,血络通畅。肝络通达，则虚可补，毒可解，瘀可祛，达到通络治疗目的。

MMP-2、MMP-9能降解基底膜的主要成分—Ⅳ型胶原，在肿瘤的转移中发挥重要作用，是参与细胞外基质代谢的最主要的蛋白水解酶类，在肿瘤浸润和转移过程中有着重要的作用[7]。本实验ELISA结果显示，经扶正解毒通络方药物处理后，基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达水平明显下降，提示扶正解毒通络方可能通过降低MMP-2和MMP-9的表达水平，进而阻止基底膜和细胞外基质地不断降解，从而抑制肝癌HepG2细胞的侵袭转移能力。

对于肝癌患者来说，肝癌细胞的侵袭和转移是影响其预后及复发的最重要因素，为了研究扶正解毒通络方对肝癌HepG2细胞侵袭能力的影响，本实验采用简单易行且重复性好的Transwell侵袭小室进行侵袭实验。结果表明，经扶正解毒通络方药物干预后，HepG2细胞穿透室膜和基质胶的数量明显减少，抑制率达52.45%，提示经扶正解毒通络方药物作用后，可显著抑制HepG2细胞的侵袭能力，此作用对延缓甚至控制肝癌转移及复发具有重要的临床意义。

综上所述，本研究表明扶正解毒通络方具有降低MMP-2和MMP-9的表达水平及抑制肿瘤转移侵袭等能力，阐述了扶正解毒通络方抗肝癌作用的部分作用机理，延缓及控制肝癌转移可能是扶正解毒通络方发挥抗肝癌作用的重要机制之一，中药复方在熬制过程中会产生复杂的化学反应，其发挥疗效的具体组分以及具体分子机制值得我们进一步研究。扶正解毒通络方是一种临床中有效的抗肝癌复方制剂，进一步深入研究可为中药复方制剂应用于肝癌的临床治疗提供有力的实验依据。

[1] 曹敬静,梁 惠,马爱国,等.EGCG对人肝癌HepG2细胞增殖和侵袭的影响[J].卫生研究,2013,42(3):460-465.

[2] 张景洲,惠 歌,冯相伟.基于“毒损肝络”理论初步探讨扶正解毒通络方抗肝癌作用机制[J].中华中医药学刊,2012,32:273-274.

[3] 刘 强,刘 静.肝细胞性肝癌相关分子信号通路的研究进展[J].世界华人消化杂志,2014,22(1):59-66.

[4] 唐婷婷,施贝德.柴胡注射液诱导HepG2细胞凋亡的实验研究[J].中国实验方剂学杂志,2013,31(9):2044-2046.

[5] 何立丽,吕文良,孙桂芝.中药提取物抗原发性肝癌的研究进展[J].中华中医药杂志,2014,29(4):1175-1178.

[6] 周晓娟,聂 广.“毒损肝络”假说及其应用价值[J].湖北中医学院学报,2010,12(2):45-49.

[7] Chen PN,Chu SC， Kuo WH，etal．Epigallocatechin-3 gallate inhibits invasion，epithelialmesenchymal transition，and tumor growth in oral cancer cells[J].J Agric Food Chem，2011,59 (8):3836-3844.

[收稿2016-12-07 修回2017-01-28]

(编辑 许四平)

Effect of Fuzheng Jiedu Tongluofang on MMP-2 and MMP-9 and invasion of human hepatoma HepG2 cells

ZHANGJing-Zhou，FENGXiang-Wei，MENGFan-Ping.

DepartmentofImmunologyandPathogenicBiology,CollegeofBasicMedicineofYanbianUniversity，Yanji133002，China

Objective:To investigate the effect and mechanism of Fuzheng Jiedu Tongluofang on the expression of MMP-2，MMP-9 and invasion of human hepatoma HepG2 cell.Methods：Hepatioma HepG2 cell was treated with Fuzheng Jiedu Tongluofang．The cell viability was measured by CCK8.The invasion of HepG2 was detected by Transwell assay．The expression of MMP-2 and MMP-9 was analyzed by ELISA． Results：In the CCK8 assay,Fuzheng Jiedu Tongluofang could inhibit the proliferation of HepG2 cells at a density and time measure.In the Transwell assay,the inhibitory rate of invasion was 52.45% when treated with Fuzheng Jiedu Tongluofang at a concentration of 2.65 mg/ml． The ELISA assay indicated that the expression of MMP-2 and MMP-9 decreased significantly after treated with Fuzheng Jiedu Tongluofang(P<0.05)． Conclusion：Fuzheng Jiedu Tongluofang suppressed the invasion of HepG2 with the possible mechanism of down-regulating the expression of MMP-2 and MMP-9 in HepG2．

Fuzheng Jiedu Tongluofang;Hepatioma HepG2 cells;MMP-2;MMP-9;Invasion

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.04.013

①本文受吉林省科技发展规划项目(330201Q00)资助。

张景洲(1978年-)，男，硕士，副教授，主要从事中医药治疗消化道系统疾病的研究，现任职于长春中医药大学附属医院，E-mail：zjz362@126.com。

及指导教师：孟繁平(1958年-)，男，博士，科主任，教授，主要从事自身免疫性疾病分子免疫学的研究，E-mail：fpmeng@ybu.edu.cn。

R392.4

A

1000-484X(2017)04-0542-03

②吉林大学第一医院,长春130021。