江苏地区汉族孕前女性中与先心病相关的MTHFR基因多态性分布研究

李孟兰　孙晓如　黄丽丽　官　燮　王丽娟　陈　伟　姜志欣　姜　晏

封　婕1　吴玉璘1　林　宁1*

1.江苏省计划生育科学技术研究所，江苏省生殖健康检验中心(南京，210036)； 2.重庆市人口和计划生育科学技术研究院

出生缺陷是国际上一个严重的公共卫生问题和社会问题，在发展中国家尤为突出。目前，我国每年新增出生缺陷约为90万例[1]，其中先天性心脏病(简称先心病)从2005年开始一直处于首位高发，给社会和家庭带来严重的经济和精神负担。先心病的发生受遗传、环境和营养因素等的共同影响，如何有效地预防先心病的发生、降低先心病患儿的出生率已成为妇幼保健工作中亟待解决的问题。本研究通过检测915名孕前汉族女性中与先心病相关的亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR )c.677C>T和c.1298A>C两个位点的基因多态性，探讨江苏地区孕前汉族女性中与先心病相关的MTHFR基因的遗传分布特征，了解备孕妇女中携带与子代先心病发生相关的风险基因的比例，为建立以个性化补充叶酸为主的预防子代先心病发生风险的一级预防管理提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

以在江苏地区苏南(丹阳市300人)、苏中(南通市310人)和苏北(沭阳县305人)3个项目点中参加孕前优生健康检查的备孕妇女共915人为研究对象，均为汉族女性，年龄(26.1±2.9)岁。对所有研究对象进行现场问卷调查并自愿签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 DNA抽提采集研究对象静脉血2ml，EDTA抗凝后保存于-80℃冰箱。室温平衡后，经蛋白酶K消化，再以酚、氯仿/异戊醇法抽提外周血白细胞中的基因组DNA。

1.2.2 MTHFR基因多态性检测以抽提的基因组DNA为模板，采用Taqman-MGB技术检测和分析各研究对象MTHFR c.677C>T、c.1298A>C的基因多态性。反应体系共6μl，其中含待测DNA样本1μl(浓度为10μg/μl)，扩增40个循环(50℃ 2min、95℃ 10min、95℃ 15s、60℃ 1min)。实验中所用仪器为美国ABI 7900HT型荧光定量PCR仪，采用配套试剂进行检测。MTHFR c.677C>T位点的探针序列(5’-3’)FAM-AAATCGGCTCCCGCA-MGB，HEX-TGAAATCGACTCCCG-MGB；c.1298A>C位点的探针序列(5’-3’)FAM-AAGACACTTTCTTCACTG-MGB；HEX-AGACACTTGCTTCAC-MGB。

1.3 统计学分析

对研究人群采用HaploView4.2软件进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验、连锁不平衡(LD)检验和单体型构建、分析。根据各研究对象的基因型结果，用Excel表分别计算3个项目点及总的等位基因频率和基因型频率，采用SPSS17.0统计学软件进行统计分析，计数资料用率表示，对各个位点的基因型频率及等位基因频率的组间比较以及江苏地区与其他省市之间基因型频率及等位基因频率的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg 平衡分析

对MTHFR c.677C>T、c.1298A>C两个位点的基因多态性进行Hardy-Weinberg平衡检验，其P值分别为0.482(c.677C>T)、0.688(c.1298A>C)，表明MTHFR c.677C>T、c.1298A>C两个位点的基因多态性符合Hardy-Weinberg遗传平衡，受检样本具有本区域群体代表性。

2.2 MTHFR多态性分布特征

苏南、苏中、苏北3个地区MTHFR c.677C>T和c.1298A>C基因型分布特征和等位基因频率详见表2、表3。与苏北地区比较，苏中地区MTHFR c.677C>T TT基因型频率和T等位基因频率均低于苏北地区(χ2=9.61，P=0.008；χ2=6.31，P=0.013)，苏南地区MTHFRc.677C>T TT基因型频率和T等位基因频率与苏北地区比较差异无统计学意义(P>0.05)；而3个地区MTHFR c.1298A>C基因型分布和等位基因频率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

表1　不同地区孕前女性MTHFR基因型频率与等位基因频率分布[例(%)]

*与苏北比较P<0.05

2.3 与其他地区MTHFR基因型和等位基因频率比较

2.3.1 MTHFR基因型在各地区汉族女性中的比较将本研究中苏中、苏南、苏北3个地区共915名受试者作为一个整体代表江苏地区与我国其他省市比较发现，江苏地区汉族孕前女性MTHFR c.677C>T和c.1298A>C两个位点基因型分布具有本地区的地域特点。本研究MTHFR c.677C>T纯合突变TT基因型频率为20.5%，显著高于湖南湘潭、广东惠州、海南省(P<0.05)，低于吉林延边、山东淄博、河南郑州(P<0.05)。结果显示TT基因型频率由南向北逐渐递增，在山东淄博达到最高(43.6%)，吉林延边又有下降趋势。本研究c.1298A>C纯合突变CC基因型频率为3.4%，高于吉林延边、山东淄博、河南郑州(P<0.05)，低于湖南湘潭、广东惠州、海南省(P<0.05)。结果显示CC基因型频率由南向北逐渐递减，在郑州达最低(1.3%)，再往北又有上升趋势。见表2。

*与本研究比较P<0.05

2.3.2 MTHFR等位基因在各地区汉族女性中的比较江苏地区汉族孕前女性MTHFR c.677C>T突变T等位基因频率为44.6%，高于湖南湘潭、广东惠州及海南省(P<0.05)，低于吉林延边、山东淄博和河南郑州(P<0.05)。c.677C>T突变T等位基因频率总体由南向北逐渐递增，在河南郑州达最高(62.3%)，再往北又有下降趋势。本研究c.1298A>C突变C等位基因频率为17.8%，高于吉林延边、山东淄博和河南郑州(P<0.05)，低于湖南湘潭、广东惠州及海南省(P<0.05)。c.1298A>C突变C等位基因频率由南向北逐渐递减，在山东淄博达最低(11.2%)，随后又有上升趋势。见表3。

表3　江苏地区孕前女性MTHFR等位基因频数和频率分布及与其他地区比较[例(%)]

*与本研究比较P<0.05

2.4 MTHFR c.677C>T和c.1298A>C两位点联合基因型频率分布及及单体型分析

MTHFR c.677C>T和c.1298A>C两个位点间具有9种联合基因型，其中CC/AA[146(16.0%)]、CC/AC[(111(12.1%)]、CC/CC[29(3.2%)]、CT/AA[293(32.0%)]、CT/AC[146(16.0)%]、TT/AA[182(19.9%)]这6种联合基因型检出频率较高，CT/CC[2(0.2%)]和TT/AC[6(0.6%)]联合基因型检出频率较低。另外，受样本量较少的限制，本研究中未检出TT/CC联合基因型。LD检验结果显示D’和r2值分别为0.90和0.14，提示MTHFR c.677C>T和c.1298A>C两个位点间存在明显的连锁不平衡现象。单体型分析结果显示两个位点间存在4种组合情况，其检出频率分别为677C-1298A(38.3%)、677T-1298A(43.9%)、677C-1298C(17.0%)、677T-1298C(0.8%)。

3 讨论

先天性心脏病是一种临床常见的出生缺陷，在临床上诊断和治疗虽然已取得显著的发展和进步，但仍是新生儿死亡的主要原因之一。近年来研究发现，同型半胱氨酸的代谢异常在先心病的发病机制中起着重要的作用，是先心病发生的独立危险因素[2]。

MTHFR是由Goyette[3]等于1994年首次克隆成功的，其基因定位于染色体1p36.3，全长19.3kb，mRNA全长为7105 bp，共12个外显子，编码含有657个氨基酸编码子的蛋白。MTHFR是叶酸和同型半胱氨酸代谢过程中的关键酶之一，负责将体内的5,10-亚甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸。5-甲基四氢叶酸作为体内叶酸的主要活性形式，是一种重要的甲基供体，在甲硫氨酸合酶催化下，可使血液中同型半胱氨酸发生再甲基化，生成甲硫氨酸，从而维持血液中同型半胱氨酸正常水平。

研究发现，MTHFR 基因具有多种基因多态性，尤以MTHFR c.677C>T位点C→T突变和MTHFR c.1298A>C位点A→C突变研究得最多，这两个位点的突变可导致酶活性和热稳定性显著降低。其中，c.677C>T 位点TT纯合突变可使酶活性下降到正常的22%。单纯MTHFR c.1298A>C位点A→C突变与酶的热稳定性无关，且对酶活性的降低影响不大，但其与c.677C>T位点存在协同作用，当两个位点为双杂合状态时，可使酶活性下降到正常的36%[4]。MTHFR酶活性的降低可导致机体叶酸代谢障碍，使血清和红细胞叶酸浓度显著降低，导致血浆同型半胱氨酸浓度显著升高[5]。同时，叶酸的缺乏和高同型半胱氨酸血症又是导致出生缺陷发生的重要危险因素，可导致神经管畸形、先天性心脏病、唐氏综合征、唇腭裂、复发性流产、妊娠期高血压等不良妊娠结局的发生[6-8]。

我们通过前期研究发现与儿童先天性心脏病发病相关的易感性基因位点为MTHFR c.1298A>C(rs1801131)，其中母亲的MTHFR c.1298A>C CC纯合突变，使其孩子发生先天性心脏病的风险增加267.0%。MTHFR c.1298A>C和c.677C>T (rs1801133)单体型分析也显示携带TC突变与先天性心脏病存在显著关联[9]。因此，我们认为 MTHFR基因多态性是子代发生先天性心脏病的风险因素之一。为进一步了解MTHFR有关风险基因在江苏地区有生育愿望的健康妇女人群中出现的几率及其与机体叶酸和同型半胱氨酸含量之间的关系，并制定个体化孕前叶酸增补方案等预防先天性心脏病的切实可行的干预措施，本文研究江苏地区孕前女性的MTHFR c.677C>T和c.1298A>C的基因多态性，并与已报道的其他地区的数据进行比较，发现苏北地区MTHFR c.677C>T纯合突变TT基因型和T等位基因频率均高于苏中和苏南地区，c.1298A>C基因型分布和等位基因频率3个地区比较未见差异。而以3个地区作为一个整体与国内其他地区比较，江苏地区汉族孕前女性MTHFR c.677C>T位点TT基因型和T等位基因频率与吉林延边[10]、山东淄博[11]、河南郑州[12]、湖南湘潭[13]、广东惠州[14]及海南省[15]比较，差异有统计学意义，TT基因型频率与T等位基因频率呈现北方高于南方的趋势；MTHFR c.1298A>C位点CC基因型和C等位基因频率与吉林延边、山东淄博、河南郑州、湖南湘潭、广东惠州及海南省比较差异有统计学意义，CC基因型频率与C等位基因频率呈现南方高于北方的趋势，与贾小平[16]等报道相似。

以上研究发现，MTHFRc.677C>T和c.1298A>C基因多态性不仅在我国南北方不同省市、不同人群之间存在差异，在江苏地区内不同地市之间也存在差异，而这种基因多态性的差异将导致不同地区、不同人群叶酸代谢的差异及叶酸缺乏的不平衡性。提示对孕前女性进行叶酸补充时要因人而异，不能使用统一的标准，也不能盲目、过多地补充不必要的叶酸制剂，以避免引起不良后果。因此，通过对孕前女性MTHFR c.677C>T和c.1298A>C两个位点基因多态性的检测,对备孕女性进行个体化的叶酸补充，从而降低先天性心脏病等出生缺陷的发生具有重要的临床指导意义。

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