仪器联用技术在硒的形态分析中的应用

王 琦闫来洪＊陈俊良

（1.中国石油大学（华东）化学工程学院，青岛266580；2.国家地质实验测试中心，北京100037）

综 述

仪器联用技术在硒的形态分析中的应用

王 琦1闫来洪1＊陈俊良2

（1.中国石油大学（华东）化学工程学院，青岛266580；2.国家地质实验测试中心，北京100037）

仪器联用技术在元素形态分析中，从样品的前处理，到分离与检测的全过程，起到十分重要的作用。本文总结了近年来仪器联用技术在硒形态分析方面的应用。

仪器联用 硒 形态分析

硒元素在1817年由瑞典化学家贝尔采利乌斯（Berzelius）发现，用希腊女神Serene的名字将其命名为“硒”。硒的物理和化学性质介于非金属元素与金属元素之间。硒元素在地壳中的含量稀少，分布分散，经计算，它的丰度按重量估计约为地壳的7 ×10－5，在所有已知化学元素中仅位于第70位。

1 硒的存在形态

在环境中，硒元素主要是以无机硒和有机硒两种形式存在，其中无机硒按照其价态可以分为单质硒、硒化物、亚硒酸盐和硒酸盐等，而有机硒主要是以蛋白（氨基酸）的形式存在［1］。水和土壤中存在着Se（IV）、Se（VI）、Se（－II）和Se（0）等不同氧化价态，易挥发的有机硒化合物，主要是以各种甲基烷基硒化合物形态存在［2］；高等植物体中的无机硒含量相对较少，大部分主要是以有机硒的形态存在［3］；在生物体中的硒元素主要以硒蛋白等有机硒化物的形态存在（表1、表2）。

2 样品前处理

样品预处理在硒的形态分析中占有极其重要的地位，样品的预处理提取率的高低对实验测定结果的准确性具有极其重要的影响。在样品的提取过程中，应尽可能的保持硒赋存形态的原始特性不变，这比仅仅检测硒元素本身要复杂得多［7］。样品的预处理过程包括对样品中的硒化物的提取、浓缩和衍生过程。在基本不改变样品中硒元素原有存在形态的前提下，将各类硒化物形式全部提取出来［8］。

表1 几种常见硒化物的结构［4］

表2 植物中有机小分子硒化合物［5，6］

目前，样品的前处理方法大致分为液相萃取（LPE），微波辅助萃取（MAE），固相微萃取（SPME）和液相微萃取（LPME）等［7］。这些样品前处理方法基本上都是在传统的浸提法［8］（去离子水浸提，酸浸提［911］和碱浸提等方法）中加以改进，延伸和发展而来，较之传统的浸提法，这些处理方法最大的特点就是样品的预处理提取率提高。李晶［9］等人在对富硒保健品中的硒形态进行提取时采用了水浴振荡的前处理方法，该处理方法简单，主要提取硒酸盐和亚硒酸盐。罗乐［10］等人研究工业废渣中的硒的多重氧化态的含量和形态时采用的是改进的SES法并且进行连续浸提的方法对工业废渣中的硒的6种形态（包括水溶态、交换态、酸溶态、有机态、单质态和残渣态）进行提取，Montes［11］等采用3种不同的提取方式提取荠菜样品中的硒。

酶解提取［911］也是近几年硒化合物提取中用到的常用方法，在这基础上也出现了一些改进的新方法，大大提高提取率，Capelo等人［12］用采用USLE消解酶新方法提取硒，他们在实验中发现蛋白酶水解的催化活性有很大提高的时候且未检测到硒形态有明显的改变，在水和甲醇混合液中用PLE提取酵母中硒形态需要10min［13］，而用USLE从硒酵母中提取硒蛋氨酸仅仅只需30s。两者相比之下，后者缩短了提取时间和提高了提取效率。对于某些具有特定基质性质的样品来说，也可以通过超滤［14］和透析的方法来实现提取目的。Olivas等人［15］首次用酶成功的提取到硒蛋氨酸。研究结果表明，用蛋白酶水解样品后发现不溶于水的物质就是硒蛋氨酸，并且提取率直接增加到95%，提取率大大提高。类似的样品前处理方法还有巯基棉分离法、离子交换分离法等。温圣平［16］提出了液相微萃取（LPME）、浊点萃取（CPE）等新型的微型化的液相萃取技术，萃取率和回收率大大提高。

3 硒形态分离与检测联用技术

联用技术是进行形态分析的最有效的手段［17］。

样品经过预处理过程后，需要对预处理过程中的提取物进行有效分离和精确检测，在这一过程中，常用的分离方法有色谱分离技术（气相色谱（GC）、高效液相色谱（HPLC））和电泳分离技术（CE）。常用的检测方法有电感耦合等离子质谱（ICP－MS）、原子荧光光谱（AFS）、原子发射光谱（AES）等。这些都是常规的分离和检测方法，近些年来，大部分的都采用联用技术，将分离与检测技术联用已达到更好的分离和检测目的。

由于食品中硒元素形态具有复杂性和多样性等特点，分离技术与定性、定量的检测技术联用已经成为目前食品中检测硒元素形态分析研究的主要方法，包括气相色谱与电感耦合等离子质谱联用（GC－ICP－MS）、液相色谱与电感耦合等离子质谱联用（HPLC－ICP－MS）、液相色谱与氢化物发生原子荧光光谱联用（HPLC－HG－AFS）、电泳与电感耦合等离子质谱联用（CE－ICP－MS）等。

3.1 气相色谱与电感耦合等离子质谱联用（GCICP－MS）

气相色谱（GC）主要用途是分离容易挥发的硒化物。目前已知的挥发性硒化物有二甲基硒和二甲基二硒，两者的检测限可达到1ng／L［18］，电感耦合等离子质谱（ICP－MS）是一种以电感耦合等离子体为离子源进行分析检测的无机质谱技术。

由于样品中气态硒化物含量一般偏低，所以在进行GC分离过程之前一般都要进行固相微萃取法（SPME）的过程，目的是将挥发性物质萃取和浓缩，以便后续分析检测，从而提高检测结果的准确度与精确度，经过GC分离的化合物仍然要保持气态的状态，这样就可以直接进入到ICP－MS中，从而省去二次雾化过程，节约时间和降低能耗，减少样品损耗，实现100%的进样，达到有效提高样品离子化效率［19］的目的。Gionfriddo等人［20］通过前期衍生反应过程，运用SPME－GC－MS联用技术对富硒马铃薯水提液中硒代蛋氨酸和硒－甲基硒代半胱氨酸含量进行分析，硒代蛋氨酸和硒－甲基硒代半胱氨酸的含量分别为8μg／kg和40μg／kg，两种硒化物的回收率达到82.3～116.3%，回收率高。Landaluze等人［21］运用SPME－GC－ICP－MS联用技术动态实时监测富硒酵母体外模拟消化过程中产生的气态硒化物，SPME浓缩过程后，用GC在5min内分离出5种不同硒化物，其中以二甲基硒和二甲基二硒醚两种硒化物的含量最高。

3.2 液相色谱与电感耦合等离子质谱联用（HPLCICP－MS）

使用不同类型的HPLC（反相色谱、排阻色谱、离子交换色谱等），对硒化物进行有效的分离，然后再进行定量分析检测。Thosaikham等人［22］以丁磺酸和三氟乙酸作为混合离子对试剂，对混合离子对试剂浓度、流动相pH、色谱柱长度和流动相流速等条件进行合理的优化，建立了RPIP－HPLC－ICPMS在线分离，检测青菜中硒化物的新方法，从而实现了对青菜中硒酸钠、亚硒酸钠、硒代半胱氨酸、硒－甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸等5种在生物体常见的含硒小分子化合物的分析和检测，这几种硒化物检出限为5～16ng／mL，各含硒化合物加标回收率达到83.5～110%。就检出限，标准曲线拟合度以及回收率等指标来看，完全达到对硒化物的准确分析和精确检测的目的。Alzate［23］等利用HPLCICP－MS对牛奶中的Se进行检测，研究无机硒向有机硒的转化机制。还有人对牛奶和大米中的硒进行检测，检测限达到0.010～0.030ng［24，25］。

罗乐［10］在应用HPLC－ICP－MS的过程中还建立了CCT动态反应碰撞模式，该模式能够有效的减少多元自离子检测的干扰状况，优化了检测环境，为多原子检测提供了方向。

同时，基于SPE的前处理方式，刘庆阳［26］建立了SPE－HPLC－ICP－MS测定水中无机硒形态，同时还建立了HPLC－ICP－MS测定葡萄酒中的无机硒形态的方法，这两种方法在实际的分析测试中应用已经很广泛。

3.3 液相色谱与氢化物发生原子荧光光谱联用（HPLC－HG－AFS）

HPLC－HG－AFS是近几年来刚发展起来的一种元素形态分析的技术，其原理是将待测样品经HPLC分离过程后，再经在线还原处理过程，将样品中的各种类型的硒化物中的硒元素还原成Se4＋，然后再利用能够产生初生态氢的硼氢化钾或硼氢化钠，与待测组分中的Se4＋反应生成气态的SeH2，气态SeH2由载气携带进入原子荧光检测器，对样品中的硒化物含量进行定性和定量。但是由于只有Se4＋能和硼氢化钾或硼氢化钠反应生成气态SeH2，所以HPLC－HG－AFS用于硒形态分析的关键在于将样品中的硒元素还原为Se4＋。目前常用的还原方式有微波（MV）辐射＋还原剂（HBr／KBrO4）和紫外线辐照（UV）。除了以上两种还原方式外，Daniel等人［27］开发一种新的还原方式—热还原模式（TR），将还原剂（KBr／HCl）与加热模块（温度达到150℃）相结合，从而实现将硒化物的还原过程，确立了HPLC－TR－HG－AFS分析硒元素形态的检测方法。在试验中，利用标准硒化物SELM－1对方法的准确度进行进一步的验证，结果表明，此种方法的准确度和精密度均与紫外线辐照（UV）相当。姚晶晶［28］等人建立了高效液相色谱－氢化物发生－原子荧光法，对茶叶中3种硒形态进行测定，检出限达到0.0007～0.0030μg／L，线性范围可以达到2个数量级以上。张硕［29］等人以液相色谱分离，在线紫外消解及蒸汽发生，高灵敏度原子荧光光谱为手段的形态分析联用系统，，并且对联用系统的操作条件进行优化，以提高形态分析的灵敏度。

3.4 电泳与电感耦合等离子质谱联用（CE－ICPMS）

在硒的赋存形态分析中，电泳与电感耦合等离子质谱联用也成为一钟常用的分析检测技术，这其中的电泳分离技术运用普遍，包括毛细管电泳（CE）和凝胶电泳（GE）两种。Zhao等人［30］运用CEICP－MS对经蛋白酶酶解的富硒大米进行分析，实验过程中发现，在18min内分离并测定出Se（VI）、Se（IV）、SeCys2和SeMet4种硒元素形态，回收率达到90～103%，实验结果表明富硒大米中的硒主要是以SeMet的形式存在。徐庆兵等人［31］运用SDS－PAGE对提取的6类来源于泥鳅的含硒蛋白进行分子量分析，实验结果发现，提取的硒蛋白样品分子量集中分布于4.1～66kDa之间，这说明硒可能倾向于与分子量较小的蛋白质或肽链结合。

此外，韩婷婷［32］等人建立了IC－HG－AFS联用技术检测海产品中的硒形态，同时分离检测硒代胱氨酸（SeCys）、硒代蛋氨酸（SeMet）、亚硒酸根Se（Ⅳ）和硒酸根Se（Ⅵ）。该测定方法对海产品中的硒形态准确、可靠、简便灵敏进行测定，也为更加科学和有效地评价海产品质量和开展海产品风险评估提供技术支撑。

国外关于硒形态分析的研究方法和应用技术的文献已经有数篇［3340］，对于联用技术的应用也十分的广泛，在这其中ICP－MS应用最为广泛，但是此联用技术受基体效应的影响，测定准确度有偏差，尤其是其与液相色谱联用时，其承受有机流动相的能力较差，也制约了其进一步的应用［4143］。因此，有人提出了VG－AFS联用技术，该应用了蒸气发生技术，在进入AFS检测器之前，待测组分已经与基体发生分离，该联用技术接近100%的进样效率，也使得VG－AFS联用技术在元素形态测定时与ICP－MS的检测能力相差无几而受到推崇［44，45］。

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Application of combined instrument in speciation analysis of selenium.

Wang Qi1，Yan Laihong1＊，Chen Junliang2

（1.College of Chemical Engineering，China University of Petroleum（East China），Qingdao

266580，China；2.National Research Center for Geoanalysis，Beijing100037，China）

The combined instrument technology plays a key role in speciation analysis of elements，from sample pretreatment to analyte detection.This paper summarized the application of combined instrument in speciation analysis of selenium in recent years.

combined instrument；selenium；speciation analysis

10.3936／j.issn.1001－232x.2017.01.001

2016－09－23

王琦，男，1993年出生，在读硕士，研究方向：环境工程，E－mail：1194698409＠qq.com。

闫来洪，男，1964年出生，副教授，研究方向：水污染控制工程，环境影响评价，E－mail：Yanlh918＠126.com。