温莉虹,林瑞泼,陈阿德,黄兆浪,郑向阳,李秧秧,黄卡特,陈国荣
(1.温州医科大学附属苍南医院 病理科,浙江 温州 325800;2.温州医科大学附属苍南医院 科教科,浙江 温州 325800;3.温州医科大学附属苍南医院 检验科,浙江 温州 325800;4.温州医科大学附属第一医院 病理科,浙江 温州 325015)
CD117和Sox10在恶性黑色素瘤中的表达及意义
温莉虹1,林瑞泼2,陈阿德3,黄兆浪1,郑向阳1,李秧秧4,黄卡特4,陈国荣4
(1.温州医科大学附属苍南医院 病理科,浙江 温州 325800;2.温州医科大学附属苍南医院 科教科,浙江 温州 325800;3.温州医科大学附属苍南医院 检验科,浙江 温州 325800;4.温州医科大学附属第一医院 病理科,浙江 温州 325015)
目的:分析黏膜、肢端和非肢端皮肤恶性黑色素瘤(MM)中CD117和Sox10表达以及c-kit基因扩增情况,探讨其与临床病理的关系。方法:PCR法检测黏膜、肢端和非肢端MM中c-kit基因的扩增量,并以色素痣作为对照。免疫组织化学法检测黏膜、肢端和非肢端MM中CD117的表达量,并与色素痣进行对照。免疫组织化学法检测黏膜、肢端和非肢端MM中Sox10、S-100和HMB45的表达,比较分析各组阳性细胞数及总的阳性率差异。结果:黏膜、肢端和非肢端MM中c-kit基因扩增量显著大于色素痣,差异有统计学意义(P<0.05)。黏膜、肢端、非肢端MM和色素痣中CD117阳性率分别为78.5%、73.6%、73.3%和25.0%,3组MM阳性率均高于色素痣(P<0.05)。3组MM中Sox10的阳性细胞数均高于S-100和HMB45,差异有统计学意义(P<0.05);Sox10、S-100和HMB45在MM中的阳性率分别为100.0%、87.5%和70.8%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论: c-kit基因扩增及CD117蛋白表达水平增高不仅可作为MM与色素痣的鉴别诊断标志,同时也为MM的靶向治疗提供靶点;Sox10阳性率可作为黑色素细胞起源的肿瘤诊断标志。
黑色素瘤;CD117;c-kit;Sox10;免疫组织化学
恶性黑色素瘤(malignant melanoma,MM)是来源于皮肤和其他器官黑色素细胞的高度恶性肿瘤[1-3],以起病隐袭、恶性程度高、转移性强、发展迅速、预后差、病死率高为特点[4-6]。目前缺乏有效的治疗方法,且其病理组织学形态多样,诊断和鉴别诊断存在困难。CD117是一种酪氨酸激酶跨膜受体蛋白[7-8],在多种类型细胞的信号传导通路中发挥作用,属于c-kit原癌基因蛋白产物,有文献报道称CD117在MM中表达增高[1]。Sox10基因位于染色体22q13.1,编码的蛋白含有466个氨基酸残基,相对分子量约51 kDa,是神经嵴来源细胞的分化标志物,对神经嵴来源的黑色素细胞的分化、成熟和维持起关键作用[9-12]。本研究观察了c-kit基因在MM中的扩增量以及CD117、Sox10蛋白在MM中的表达,探讨MM的诊断、鉴别诊断和可能的治疗靶点。
1.1 材料 收集苍南县人民医院及温州医科大学附属第一医院2008-2014年住院或门诊诊断为MM的组织标本48例(其中黏膜、肢端和非肢端MM分别为14、19和15例),色素痣12例,均经HE染色及病理证实。
1.2 方法
1.2.1 染色:所有标本均经4%中性甲醛溶液固定。
常规脱水、石蜡包埋,切片厚3 μm,行HE染色、免疫组织化学染色。CD117一抗购于上海长岛生物技术有限公司,Sox10、S-100和HMB45一抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司,均为单克隆抗体,以PBS代替一抗作为对照。
1.2.2 免疫组织化学结果判读:CD117细胞浆/膜棕黄色为阳性表达,Sox10细胞核棕黄色为阳性表达,S-100细胞核/浆棕黄色为阳性表达,HMB45细胞浆棕黄色为阳性表达。各组全部样本每例随机选取3个视野计数阳性细胞数,每个视野为195.0 μm× 165.8 μm。
1.2.3 PCR检测:选取CD117阳性的色素痣和MM标本进行PCR检测石蜡包埋组织中c-kit 11外显子基因的表达情况。引物由美国Invitrogen公司合成。引物序列如下:上游:5’-CCAGAGTGCTCTAATGACTG-3’,下游5’-T GACATGGAAAGCCCCTGTT-3’。PCR反应条件为:初始变性95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,57 ℃30 s,72 ℃ 45 s,40个循环;72 ℃延伸7 min。反应在ABI StepOne中运行。扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,于凝胶成像系统SYDR/1960下采集图像并分析。
1.3 统计学处理方法 应用SPSSl7.0统计软件。计量资料用±s表示,组间差异采用单因素方差分析;计数资料采用卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 CD117的表达情况
由图1可见,色素痣细胞胞浆/膜中只见少量棕色颗粒,而黏膜、肢端和非肢端MM瘤细胞胞浆/膜中可见中等量棕色颗粒,说明MM中的CD117表达量显著增高。统计分析结果显示,黏膜、肢端和非肢端MM的阳性细胞数分别为180±5、170±5和170±4,与色素痣(30±2)比较,差异有统计学意义(P<0.01)。黏膜、肢端、非肢端MM中CD117阳性率分别为78.5%(11/14)、73.6%(14/19)、73.3%(11/15),高于色素痣的25.0%(3/12),差异有统计学意义(χ2=7.462、7.309、6.328,均P<0.05)。
图1 CD117在色素痣和MM中的表达(SP,×100)
2.2 c-kit基因扩增情况
由图2可见,黏膜、肢端和非肢端MM分别与色素痣比较,其c-kit基因扩增量明显增加,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。
2.3 Sox10表达情况
如图3所示,Sox10为核染,S-100核/浆染色,HMB45为胞浆染色。黏膜、肢端和非肢端MM中的Sox10分别与S-100、HMB45比较,阳性细胞数差异有统计学意义(P<0.05),见表1;3组MM中Sox10的阳性率为100%,高于S-100的87.5%和HMB45的70.8%,差异有统计学意义(χ2=6.40、16.39,P<0.05和P<0.01)。
图2 黏膜、肢端、非肢端MM和色素痣组织中c-kit基因扩增情况
MM是一种高度恶性肿瘤,约占全部皮肤肿瘤的3%,其死亡病例却占皮肤肿瘤的65%[13]。近年来,MM全球发病率呈逐年递增趋势。目前,对于MM的病理诊断较困难,易误诊。MM细胞形态多变,细胞核多形异染,可见噬伊红大核仁,核分裂多见,与部分良性痣如Spitz痣的鉴别存在困难,同时也易与某些上皮及间叶组织的非黑色素细胞来源的肿瘤混淆,因此在病理诊断中对于细胞良恶性及细胞来源的鉴别显得尤为重要。本研究对MM中CD117和Sox10的表达情况进行了探讨,为MM的临床诊断和治疗提供依据。
CD117是原癌基因c-kit的蛋白产物,是一种跨膜的酪氨酸酶受体蛋白,可激活酪氨酸激酶信号传导通路,促进细胞生长、增殖和分化[1,14-15]。本研究通过免疫组织化学法检测色素痣以及黏膜、肢端、非肢端MM中CD117的表达情况,结果显示3组MM样本组织中CD117的表达量及阳性率均高于色素痣,提示CD117可作为鉴别黑色素细胞来源的良恶性肿瘤的标志。CD117表达量取决于c-kit基因的扩增量,本研究PCR检测结果显示,c-kit基因的扩增量与CD117的表达量相一致,MM组织中的c-kit基因扩增量显著大于色素痣,因此,我们推断,MM的发生可能与c-kit基因表达上调有关,故探讨针对c-kit靶点的靶向药物治疗,可能为MM的治疗提供一个新的途径。
图3 黏膜、肢端、非肢端MM中Sox10、S-100和HMB45免疫组织化学染色结果(SP,×100)
表1 Sox10、S-100和HMB45在MM中的阳性细胞数比较(±s)
表1 Sox10、S-100和HMB45在MM中的阳性细胞数比较(±s)
与S-100比:aP<0.05;与HMB45比:bP<0.01
Sox10是一种新近发现的黑色素细胞的标记[12],在神经嵴演变早期背神经管中表达,然后随着神经嵴干细胞的分化,表达于其衍生物如周围神经系统和黑色素细胞中。Sox10与其他转录因子协同指导黑色素细胞发育和分化[16]。本研究发现Sox10在MM中的表达量及阳性率均高于S-100和HMB45,因此Sox10是一种比S-100和HMB45更加有效的黑色素细胞来源的肿瘤标志物,可用于黑色素细胞肿瘤与非黑色素细胞肿瘤的鉴别诊断。
综上所述,本研究结果提示c-kit基因及CD117可作为鉴别黑色素细胞来源的良恶性肿瘤的标志;Sox10可用于黑色素细胞肿瘤与非黑色素细胞肿瘤的鉴别诊断。
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(本文编辑:丁敏娇)
Expression and signif cance of CD117 and Sox10 in malignant melanoma
Objective:To analyze the value of CD117, Sox10 expression and c-kit gene amplif cation in mucous, acral and non-acral melanoma and explore the relationship between it and clinical pathology.Methods:The gene levels of c-kit in mucosal, acral and non acral melanoma were detected by PCR, with pigmented nevus as control. The protein expressions of CD117, sox10, 1-100 and HMB45 were detected by immunohistochemistry.Results:The expression of c-kit gene from the three MM groups was higher than that of pigmented nevus (P<0.05). The immunohistochemical results demonstrated that the number of positive cells of CD117 from the three MM groups was marginally higher than that of pigmented nevus (P<0.05). The number of positive cells of Sox10 in the three MM groups was higher than that of S-100 and HMB45 (P<0.05). The positive rate of CD117 in mucosal, acral and non acral MM was 78.5%, 73.6% and 73.3% respectively, while 25% in pigmented nevus control (P<0.05). The positive rate of Sox10, S-100 and HMB45 in MM was 100.0%, 87.5% and 70.8% respectively (P<0.05).Conclusion:C-kit gene amplif cation and its downstream transcription protein CD117 enhanced positive expression can be applied as clinical potential therapy target. The positive rate of Sox10 is higher than S-100 and HMB45, and may be applied as tumor differentiation marker for origins of melanocytes.
melanoma; CD117; c-kit; Sox10; immunohistochemistry
R365
A
10.3969/j.issn.2095-9400.2017.03.009
2016-09-18
苍南县科技计划项目(2015S05);温州市科技局科研基金资助项目(Y20130001);浙江省科技厅国际合作项目(2013C24031)。
温莉虹(1980-),女,浙江苍南人,副主任医师。
陈国荣,教授,主任医师,硕士生导师,Email:chengr1978@aliyun.com。
WEN Lihong1, LIN Ruipo2, CHEN Ade3, HUANG Zhaolang1, ZHENG Xiangyang1, LI Yangyang4, HUANG Kate4, CHEN Guorong4.
1.Department of Pathology, the Aff liated Cangnan Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325800; 2.Department of Science and Education, the Aff liated Cangnan Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325800; 3.Department of Clinical Laboratory, the Aff liated Cangnan Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325800; 4.Department of Pathology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015