牛血清白蛋白模板法制备的金属复合纳米材料 在生物检测中的应用

何少斌, 张一帆, 黄惠南, 林志强*, 陈 伟

(1.泉州市传染病防治医院,福建泉州 362000; 2.泉州市第一医院,福建泉州 362000;3.福建医科大学纳米医学技术研究所,福建福州 350000)

1 引言

生物在进化过程中形成外形多样化并能在生物体复制的复杂生物，而自身通过生物矿化形成硬质的无机材料[1 - 3]，如趋磁性细菌产生Fe3O4或FeS纳米粒子，可以在磁场定位和迁移[4 - 5]，海胆的脊椎内能形成非晶相的矿化物[6]，海绵产生有光导纤维特性的SiO2，硅藻产生SiO2作为细胞壁等[7 - 10]。科学家研究发现用生物分子中的小肽或蛋白质制备纳米材料是一种有效手段，在表面修饰以及生物检测等领域有应用前景。生物转化过程可以在温和条件下进行,利用生物体或生物质为模板还原制备纳米颗粒过程环保，可以充分利用绿色的生物质资源[11]，因而通过生物矿化法，利用蛋白质为模板合成特异性多功能纳米材料成为近年来的热点。一些常见的蛋白质在序列性质上与矿化的蛋白质相似，利用这些蛋白质作为模板制备纳米材料具有明显优势[12]，如溶菌酶[13]、淀粉酶[14]、胃蛋白酶[15]以及牛血清白蛋白(BSA)[16]等。

BSA包含583个氨基酸残基，等电点为4.7，在生化实验中常作为封闭剂(Blocking Agent)应用在免疫印迹技术(Western Blot)中。结合纳米金属材料(Au、Ag、Cu、Pt)优良的电学、荧光、催化等性能，BSA模板法制备金属纳米材料在近年得到飞速发展。酪氨酸的酚羟基，天冬氨酸的羧基等，使BSA不仅是模板，也是离子的还原剂，BSA外壳也可明显提高材料的稳定性，易于表面修饰等优势，此外，半胱氨酸残基还能够用于量子点的生长[17 - 18]。本文就近年来利用BSA为模板制备金属复合纳米材料的研究进行综述，包括种类、合成方法、性能和在生物检测中的应用。

2 牛血清白蛋白-金属复合纳米材料的制备及应用

2.1 牛血清白蛋白-金复合纳米材料

Xie等[19]首先报道BSA介导的红色荧光金纳米簇(BSA-AuNCs的制备)，在碱性条件下BSA中的还原基团还原氯金酸生成Au纳米簇，合成过程温和无毒，且产物拥有尺寸小、水溶性好、易于修饰、模拟酶活性好及荧光量子产率高等优点，在传感检测、纳米标记、医学成像和光电子学等领域具有潜质。随后，越来越多与BSA-AuNCs相关的制备方法及检测方法被陆续报道。BSA-AuNCs作为荧光探针已成功用于阳离子、阴离子及重要的生物物质，如H2O2、葡萄糖、谷胱甘肽、三磷酸腺苷、氨基酸等小分子化合物的检测，利用其模拟酶活性，H2O2、黄嘌呤、尿酸被成功检测。

2.1.1基于BSA-AuNCs荧光特性的离子检测作为一种普遍存在于大自然中的有毒离子，Hg2+可对大脑、神经系统和肾脏等造成极大的伤害，因此对Hg2+的检测尤为重要。已合成的BSA-AuNCs荧光团簇由25个金原子组成，具有红色荧光(发射波长=640 nm)，荧光量子产率为6%。Xie等[20]的研究认为Hg2+与Au+能够相互作用，该作用使原本拥有荧光的BSA-AuNCs发生荧光猝灭，Hg2+的检测限可低至0.5 nmol/L。Hu等[21]同样利用Hg2+对BSA-AuNCs荧光选择性猝灭作用，成功检测湖水、自来水等实际样品中的Hg2+，检测限为80 nmol/L。Hu提出了可能的检测机制，认为检测过程是光诱导电子转移的过程，该过程的BSA-AuNCs与Hg2+首先通过Hg-S键结合，电子在光照条件下被激发到激发态，Hg2+拦截电子还原成Hg+，从而破坏了空穴和激发电子的辐射重组，进而抑制荧光特性。随着BSA-AuNCs研究的进展，Wang等[22]提出了不同的抑制机理，认为Hg2+是结合BSA表面丰富的氨基和羧基导致金纳米簇荧光猝灭，利用此机理构建了Hg2+的检测体系，检测限为0.1 nmol/L，该方法成功应用于湖水中Hg2+的检测。在Hg2+检测的启发下，更多的团队借鉴并取得不错的研究进展[23 - 24]。

Sreenivasan等[25]在研究离子对BSA-AuNCs的影响时发现，Cu2+能够与包覆表面的BSA结合从而影响AuNCs的荧光，该检测方法成功地检测了活体细胞中的Cu2+，方法的检测限为50 μmol/L。根据BSA在等电点时有很好的成膜能力，Chi等[26]制备了荧光金纳米簇膜(FGM)，利用Cu2+对FGM的荧光抑制检测Cu2+，此外加入组氨酸可以恢复FGM的荧光，继而达到FGM的可持续使用性，Cu2+的检测限为0.5 μmol/L。Yu等[27]发现利用超声化学法合成的BSA-AuNCs可以提高其对Cu2+的灵敏检测，其检测限低至0.3 nmol/L。

Chen等[28]首次利用BSA-AuNCs的电致化学发光实现了对Pb2+的检测，推测其原理为：当Pb2+的加入，因与硫键有较强的结合力，使得BSA-AuNCs的电致化学发光强度降低，从而实现对Pb2+的检测。Zheng等[29]提出了Ni2+与BSA-AuNCs之间的静态抑制作用，进而抑制了Au纳米簇的荧光强度，其检测限为10 nmol/L。Wu等[30]利用微波辅助合成荧光增强传感器，其内核有16个纳米Au原子，Ag+通过金属键结合后被BSA还原沉积在纳米Au表面，使得荧光增强，从而测定Ag+，检测限为0.10 μmol/L。CN-能够通过生物链的富集作用沉积在生物体内使其引发疾病，对人体也有抑制中枢神经系统的作用，因而对于CN-的检测有重要意义。Lu[31]的团队发现CN-能够作用Au原子发生刻蚀，通过此作用能够是BSA-AuNCs荧光猝灭，CN-的检测限为200 nmol/L。

2.1.2基于BSA-AuNCs荧光特性的生物分子检测根据Chang等[32]所述原理，H2O2能够氧化Au-S键是其成为有机二硫化物，导致荧光减弱。基于相同的原理，Dong等[33]合成BSA-AuNCs检测H2O2，检测限为300 nmol/L。Dong的团队还检测了血液的葡萄糖，利用葡萄糖氧化酶系统和BSA-AuNCs可间接地检测葡萄糖，检测限为5.0 μmol/L。脑内的乙酰胆碱与认知活动，神经信号的传递密切相关，基于乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶系统，可将乙酰胆碱选择性水解和氧化为H2O2，如先前所述，Chen等[34]利用H2O2抑制BSA-AuNCs的荧光可检测乙酰胆碱的含量，其检测范围为0.1～20 nmol/L，检测限为5 pmol/L。

众所周知，氨基酸作为构建生物机体的生物分子，也是构建细胞的基本。Zhang等[35]利用BSA-AuNCs中的BSA和AuNCs分别具有蓝色和红色荧光(发射波长在425和635 nm)，通过静电的作用制成BSA-AuNCs-Ni2+、BSA-AuNCs-Pb2+、BSA-AuNCs-Cd2+和BSA-AuNCs-Zn2+，利用氨基酸与上述离子的结合使得BSA-AuNCs荧光增强，可以实现对不同氨基酸的检测。基于BSA-AuNCs-Ni2+，Song等[36]成功检测了人体血样的组氨酸，检测限为30 nmol/L，原理认为是因为Ni2+与组氨酸的氨基、羧基以及咪唑相结合，成功恢复了BSA-AuNCs的荧光。Liu等[37]提出半胱氨酸可以通过其巯基与BSA-AuNCs结合降低其表面缺陷使得BSA-AuNCs的荧光增强，检测限为1.2 nmol/L，此为少数通过荧光增强机理用BSA-AuNCs检测有机分子的方法之一。作为氨基酸衍生物及重要的抗肿瘤药物，甲氨蝶呤可线性抑制BSA-AuNCs的荧光从而被检测，Chen等[38]成功检测了人体尿液的甲氨蝶呤，检测限为0.9 ng/mL。Yao等[39]基于BSA-AuNCs荧光检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂的方法，其实验原理认为是在BSA-AuNCs和木瓜蛋白酶体系中，当没有半胱氨酸蛋白酶抑制剂，木瓜蛋白酶会分解BSA导致Au纳米簇荧光的猝灭，反之荧光则不会猝灭，从而检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂，检测限为4.0 ng/mL。

一些有机小分子如戊二醛、维生素B12、焦磷酸盐、多巴胺等也都先后被验证了对Au纳米簇的荧光有响应。由于戊二醛与氨基生成希夫碱，Hou等[40]用BSA-AuNCs检测了水样中的戊二醛，戊二醛与BSA的结合使得Au的荧光抑制，检测限为200 nmol/L。维生素B12能后参与骨髓红细胞的制造，防止大脑神经被破坏，Shamsipur等[41]报道了用BSA-AuNCs检测维生素B12，由于两者发生荧光能量转移，可以用来检测维生素B12，其灵敏性好，可用于医药制剂中维生素B12的检测。Liu等[42]利用Cu2+与BSA中的甘氨酸结合实现BSA-AuNCs荧光猝灭，再利用焦磷酸与Cu2+的结合增强BSA-AuNCs的荧光，可检测焦磷酸，其检测限为83 nmol/L。

胰蛋白酶是蛋白酶的一种，作为胰液的成分而分泌，是胰腺独有的肽链内切酶，在小肠中对蛋白质消化有着无法替代的作用，它在体内的数值与急性胰腺炎、胰腺癌患者和囊性纤维化等胰腺疾病密切相关。Xu等[43]基于BSA-AuNCs荧光抑制成功检测了胰蛋白酶的浓度，线性范围为0.01～100 μg/mL，检测限为2 ng/mL，并验证了该方法在尿液样品中胰蛋白酶的检测，该方法可应用于胰腺疾病的初步筛查，具有潜在的临床意义。

2.1.3基于BSA-AuNCs模拟酶的检测近年来，模拟酶特性成为研究热点。过氧化物酶可高效催化氧化H2O2，而H2O2又是生物反应中重要的中间物质，对H2O2以及相关生化物质的测定对临床诊断具有重要的意义[44]。过氧化物模拟酶涉及的物质包括Fe3O4纳米粒子，血红蛋白，氯化血红素，金属卟啉，金属酞菁等[45 - 50]。除了荧光特性，BSA-AuNCs被证实具有过氧化物模拟酶活性。

Wang等[51]利用BSA-AuNCs的模拟酶活性，催化底物TMB显色，选择性检测了黄嘌呤，黄嘌呤是一种广泛分布于人体及其他生物体的器官及体液内的一种嘌呤碱，在黄嘌呤氧化酶的作用下转换为尿酸和H2O2，也是心肌缺血、烧伤及痛风等疾病的指标之一，检测H2O2的检测限为20 nmol/L，黄嘌呤的检测限为500 nmol/L，并成功应用在检测尿液和血清的黄嘌呤。此后，Zhao等[52]研究了利用过氧化物模拟酶检测尿酸并验证了其在人体血清中的可行性，检测限为360 nmol/L。Qu等[53]利用BSA-AuNCs的荧光和模拟酶双特性构建检测多巴胺的方法。多巴胺是神经传导物质，用来帮助细胞传送脉冲的化学物质，在Qu的文章中，基于BSA-AuNCs的荧光抑制，并用多巴胺对过氧化物酶活性的抑制选择性两种方法检测了多巴胺，其检测限都为10 nmol/L，该团队将此方法成功应用在盐酸盐、人体血清及PC12细胞的多巴胺检测上。

2.2 牛血清白蛋白-Ag复合纳米材料

由于具有荧光、生物相容等特性，Ag纳米簇引起了广泛的兴趣，在分析化学、纳米材料科学、生物学、医学等领域都有很重要的研究价值。近年来，Ag纳米簇被密集的报道作为荧光纳米簇探针[54]，用于检测多种目标物。Schneider等[55]研究了牛血清白蛋白-银纳米簇(BSA-AgNCs)的制备方法，利用BSA为模板，与AgNO3混合后，加入硼氢化钠生成BSA-AgNCs。Pradeep等[56]发现在碱性条件下可以生成15个银原子的BSA-AgNCs，拥有优秀的荧光特性。Yang等[57]发现BSA-AgNCs不仅拥有稳定的荧光，并能够有很好的催化活性，能够是Ag+在抗环血酸存在下还原成银纳米粒子。由于银纳米粒子拥有明显的颜色和等离子共振峰，能够利用此定量检测抗环血酸，其检测限为160 nmol/L。利用Pradeep的方法制备15个原子的BSA-AgNCs，其拥有两个发射波长480 nm和634 nm。Lu等[58]发现，随着Hg2+的加入，BSA-AgNCs在480 nm的荧光峰强度会增加，而634 nm处的荧光峰强度减少，通过两个荧光峰强度的比例可以定量检测Hg2+，该方法不仅荧光有明显变化，也可以通过可见光得以区别，检测限为48.7 nmol/L。

2.3 牛血清白蛋白-Cu复合纳米材料

目前对亚纳米尺度上过渡金属纳米团簇研究主要集中于贵金属Au和Ag，而对处于同族(IB)的Cu纳米团簇研究相对较少。采用传统方法得到的Cu纳米粒子尺寸较大，且较易氧化。因此稳定的Cu纳米团簇合成方法是金属团簇研究中具有挑战性的课题之一。Pradeep等[59]利用仿生物矿化法，在碱性条件下合成了牛血清白蛋白-铜纳米簇(BSA-CuNCs)，其拥有很好的荧光特性，在420 nm处有发射波长。该团队利用其荧光特性可以被Pb2+选择性抑制而用来检测Pb2+，并验证了水体中Pb2+的检测。由蛋白质模板的铜纳米簇能同时拥有稳定性和荧光特性，除此之外，Hu等[60]验证了BSA-CuNCs的模拟酶活性，利用BSA-CuNCs良好的过氧化物酶活性，催化H2O2显色底物TMB，从而检测了H2O2和葡萄糖，H2O2检测限为10 μmol/L。葡萄糖是由葡萄糖氧化酶选择性氧化生成目标物质H2O2，检测限为100 μmol/L。Cu的稳定性相对贵金属较低，研究热度也远远低于贵金属，但由于便宜、易得及独特的性质值得进一步研究和开发。

2.4 牛血清白蛋白-MnO2复合纳米材料

Mn氧化物具有良好的氧电还原催化活性,且价格低廉、丰富易得、环境友好，已作为潜在的金属空气电池阴极催化材料得到研究。近年来纳米材料的发展为Mn氧化物提供了新的契机，水溶性好和分散性好的无机纳米材料作为模拟酶也一直备受关注。Liu等[61]利用牛血清蛋白为生物模板控制合成MnO2纳米粒子，制备方法简单，反应条件温和，成本低，所需试剂少，对环境友好，且得到了分散性好、生物相容性好、粒径较小、尺寸一致、形貌均一的MnO2纳米粒子。利用此制备方法，Liu进而证明了BSA-MnO2NPs同时拥有模拟氧化酶和过氧化物酶的特性，利用其氧化酶活性和BSA上的交联基团，成功应用在免疫分析羊抗人-IgG的检测。Liu[62]的团队进而利用BSA-MnO2NPs的氧化酶活性催化TMB显色检测了谷胱甘肽。该团队认为在BSA-MnO2NPs氧化了TMB体系后，加入谷胱甘肽能够还原已经显色的TMB，从而使显色效果降低，该方法成功检测了谷胱甘肽，其检测限为100 nmol/L。此方法实现了血清样品中的回收率试验验证了方法的可行性。

2.5 牛血清白蛋白-Pt复合纳米材料

He等[63]以BSA为模板模拟生物矿化作用制备核壳结构的牛血清白蛋白-Pt纳米粒子(BSA-PtNPs)。蛋白质模板控制金属内核的形貌与尺寸，对PtNPs内核具有很强的稳定作用。BSA-PtNPs拥有良好的过氧化物酶活性，在H2O2和一定的条件下，能够催化多种不同的过氧化物酶显色底物显色，其对TMB的亲和力超过了辣根过氧化物酶，其极强的稳定性使其能够在高盐浓度中保持很好的活性，很好地解决了材料团聚沉降的问题。利用强稳定性特性，He的团队构建了TOPS-4-AAP-BSA-PtNPs-H2O2显色体系，直接应用检测婴儿奶粉的胆碱和血浆的乙酰胆碱，紫外吸光度与胆碱浓度在6～400 μmol/L范围内呈线性关系，检测限为2.5 μmol/L；乙酰胆碱的线性范围为10～200 μmol/L，检测限为2.84 μmol/L。该方法灵敏度高且能够替代现有的方法进行检测，文章并首次提出该材料的蛋白质防污染特性，对材料的研究和应用奠定很好的基础[64]。在制备方法方面，Ai等[65]研究了在酸性(pH=3.2)条件下制备另一种BSA-PtNPs，并利用TMB显色体系检测了H2O2，检测限为7.9 μmol/L。蛋白质外壳的结构除了使其拥有很好地稳定性，也决定了BSA-PtNPs可拥有蛋白质的相关功能，如联接标记分子，催化功能，识别作用等，结合Pt的优秀稳定性和原子特性，拥有诱人的发展前景。

3 展望

综上所述，牛血清白蛋白模板法制备的金属复合纳米材料不仅具有制备简单、经济、快捷、耐高温和耐酸碱、性质稳定等诸多优势，而且在上述的离子检测、免疫分析、生物分子检测等方面已经显示出广阔的应用前景，特别是基于纳米材料构建的疾病诊断、病理组织检测、药物筛选等生物和医学的研究方法具有非常重要的现实意义。相信在不久的将来，利用牛血清白蛋白-金属复合纳米材料构建的方法能被广泛地开发并应用于上述的学科领域。