多发性骨髓瘤中c-myc和MDM2蛋白的表达及其临床意义

赵志华，田 研，陈奎生

多发性骨髓瘤中c-myc和MDM2蛋白的表达及其临床意义

赵志华，田 研，陈奎生

目的 探讨c-myc蛋白及小鼠双微体基因(murine double minute 2, MDM2)蛋白在多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)中的表达及其与临床分期的相关性。方法 采用免疫组化SP三步法检测60例不同临床分期MM组织和10例非肿瘤骨髓组织中c-myc蛋白及MDM2蛋白的表达。结果 c-myc蛋白在MM及非肿瘤骨髓组织中的阳性率分别为71.7%、10.0%，MDM2蛋白在MM及非肿瘤骨髓组织中的阳性率分别为80.0%、20.0%，两者在MM及非肿瘤骨髓组织中的表达差异有统计学意义(P<0.05)。两者表达与MM的临床分期呈正相关性(P<0.05)，与MM患者性别、年龄无相关性。MM中c-myc蛋白和MDM2蛋白的表达呈正相关(P<0.05)。结论 c-myc蛋白和MDM2蛋白在MM中高表达，其可能与MM的发生及临床分期有关；在MM中，c-myc蛋白和MDM2蛋白可能具有协同作用，共同促进肿瘤的发展。

骨肿瘤；多发性骨髓瘤；c-myc蛋白；MDM2蛋白；临床分期

c-myc基因是myc癌基因家族成员之一，其异常表达在调节细胞的恶性转化、生长及分化中发挥重要作用；小鼠双微体基因(murine double minute 2, MDM2)是一种原癌基因，其通过激活E2F-1可以促进细胞G1→S期的转变，通过抑制野生型p53的功能可以调控细胞的增殖、凋亡。c-myc或MDM2蛋白在许多恶性肿瘤内有较高的表达水平，因此，靶向作用于c-myc或MDM2及其相关基因有可能成为肿瘤治疗的有效途径之一。c-myc蛋白或MDM2蛋白在多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)中表达的报道较少[1-3]，联合检测c-myc和MDM2蛋白在MM组织中的表达，目前尚未见相关报道。本文旨在探讨c-myc和MDM2蛋白在不同临床分期MM中的表达，以期了解两者在MM发生、发展中的意义及其与临床分期的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料 选取郑州大学第一附属医院2013年8月～2015年12月期间存档的MM石蜡标本60例，以及非肿瘤骨髓组织石蜡切片10例，均有完整的临床病理资料，诊断均符合国内MM的诊断标准。60例MM中，男性34例，女性26例，年龄24～84岁，中位年龄59岁。根据国际分期系统(international staging system, ISS)标准对MM病例进行分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期18例，Ⅲ期24例。10例非肿瘤骨髓组织标本中，男性3例，女性7例，年龄15～74岁，中位年龄56岁。

1.2 试剂 兔抗c-myc多克隆抗体和鼠抗MDM2单克隆抗体均购于上海迈新生物公司，通用型SP三步法试剂盒、DAB显色试剂盒均购于北京中杉金桥公司。

1.3 方法 所有MM及非肿瘤骨髓组织标本均经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋后制片。应用免疫组化SP三步法进行检测。实验采用柠檬酸高压抗原热修复法进行抗原修复，3%H2O2室温孵育20 min，以灭活其过氧化物酶活性，PBS液冲洗，正常山羊血清工作液室温孵育20 min，滴加一抗，4 ℃冰箱过夜12 h，PBS液冲洗，滴加通用型二抗，室温孵育25 min，PBS液冲洗，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液室温孵育25 min，PBS液冲洗并用DAB显色液显色，最后用蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片。

1.4 结果判断 参照半定量积分法进行结果判读。每张切片随机选取10个高倍视野观察，按肿瘤细胞着色深浅分成4个等级：不着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。按阳性细胞占肿瘤细胞百分比分成5个等级：阳性细胞数<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。将两项得分结果相加：0～1分为(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为阳性()，6～7分为强阳性()，其中(+～)均判读为阳性。

1.5 统计学方法 采用SPSS 21.0软件处理数据，对计数资料采用χ2检验，对相关性分析采用Spearman等级相关分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 c-myc和MDM2蛋白在MM及非肿瘤骨髓组织中的表达 c-myc蛋白阳性表达主要位于肿瘤细胞核(图1)，MDM2蛋白阳性表达主要位于肿瘤细胞胞核和胞质(图2)，两者在非肿瘤骨髓组织中可呈散在的细胞阳性(图3、4)。c-myc和MDM2蛋白在MM与非肿瘤骨髓组织中的表达差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

表1 c-myc和MDM2蛋白在MM和非肿瘤骨髓组织中的表达(%)

*P<0.05，**P<0.05

2.2 c-myc和MDM2蛋白在不同临床分期MM组织中的表达及其相关性 c-myc蛋白与MM临床分期的相关系数r=0.431，P<0.05，即c-myc蛋白表达与MM临床分期有相关性；MDM2蛋白与MM临床分期的相关系数r=0.389，P<0.05，即MDM2蛋白表达与MM临床分期有相关性(图5、6，表2)。

表2 c-myc和MDM2蛋白在不同临床分期MM组织中的表达(%)

2.3 c-myc和MDM2蛋白的表达与MM临床参数的关系 c-myc和MDM2蛋白表达均与MM患者性别、年龄无相关性(P>0.05，表3)。

2.4 MM中c-myc和MDM2蛋白表达的相关性 经Spearman等级相关性分析，结果提示c-myc与MDM2蛋白表达呈正相关(r=0.316，P<0.05)。

3 讨论

表3 c-myc、MDM2蛋白表达与MM临床参数的关系(%)

MM是起源于骨髓中B淋巴细胞的单克隆浆细胞恶性肿瘤，是最常见发生于骨的淋巴造血系统肿瘤。据统计，MM占所有肿瘤的1.0%，占血液系统疾病恶性肿瘤的10%[4]。随着我国人口平均寿命的延长，MM的发病率逐年增加，严重威胁人类的身心健康和生命。目前其治疗主要依靠硼替佐米等药物以及造血干细胞移植术，但这并不能达到临床治愈的目的。由于MM发病机制不清，无法治愈，尤其是临床分期越高，预后越差。因此探讨MM的发生、发展机制，寻找其临床治疗的可能靶点及预后判断指标成为当前的研究热点。

c-myc基因是myc癌基因家族成员之一，也是myc家族中涉及到恶性肿瘤发展的最主要致癌基因，其在细胞的生长调控中起到关键作用。c-myc基因可以促进细胞的增殖，抑制细胞的分化，而且c-myc异常表达的产物在调节细胞的恶性转化中发挥重要作用[5-6]。c-myc还可以调控细胞的周期[7]，其可以促使细胞由G1期进入S期，进而激活DNA的合成，促进细胞周期的进程。Zeng等[8]通过免疫组化检测c-myc蛋白在前列腺癌的表达及其与预后的关系，发现c-myc蛋白在前列腺癌中高表达，并且与临床分期相关，提示c-myc蛋白与前列腺癌的发生及预后有相关性。本组实验对MM及非肿瘤骨髓组织中c-myc蛋白表达进行检测，结果显示，c-myc蛋白在MM中的阳性率为71.7%，非肿瘤骨髓组织中c-myc蛋白阳性率为10.0%，其在MM与非肿瘤骨髓组织的表达差异有统计学意义，提示c-myc蛋白与MM的发生可能有一定关系。c-myc蛋白与MM临床分期的相关系数r=0.431，P<0.05，可认为c-myc蛋白表达与MM的不同临床分期密切相关，在肿瘤中随着分期的增加，其阳性率增高，提示c-myc蛋白与MM预后相关，阳性率越高，其预后越差。本组实验结果与Zeng等[5]研究报道一致，进一步证实c-myc与恶性肿瘤的发生、发展密切相关，深入研究c-myc依赖的细胞周期调控机制，将有助于恶性肿瘤治疗靶点的发现。

图1 c-myc蛋白在MM中的表达，SP9000三步法 图2 MDM2蛋白在MM中的表达，SP9000三步法 图3 c-myc蛋白在非肿瘤骨髓组织中的表达，SP9000三步法 图4 MDM2蛋白在非肿瘤骨髓组织中的表达，SP9000三步法 图5 c-myc蛋白在不同临床分期MM中的表达：A.Ⅰ期；B.Ⅱ期；C.Ⅲ期，SP9000三步法 图6 MDM2蛋白在不同临床分期MM中的表达：A.Ⅰ期；B.Ⅱ期；C.Ⅲ期，SP9000三步法

MDM2是一种原癌基因，最初是从含有双微体的小鼠成纤维母细胞中克隆出的一个高度扩增的基因[9]。其可以诱导细胞由G1期进入S期[10]，进而促使细胞进入细胞周期的循环。MDM2常常抑制野生型p53介导的细胞凋亡，进而提高细胞的生存率。MDM2是一个重要的p53负向调节器，其主要功能是降低p53蛋白的水平并抑制其活性[11-13]。因而，MDM2既可以促进细胞的增殖又可以促进细胞的存活。Sugano等[14]采用RT-PCR法检测结直肠癌中MDM2基因的扩增，发现MDM2的高表达与结直肠癌的临床分期相关，其阳性率越高，预后越差。本组实验对MM及非肿瘤骨髓组织中MDM2蛋白表达进行检测，结果显示，MDM2蛋白在MM中的阳性率为80.0%，非肿瘤骨髓组织中MDM2蛋白阳性率为20.0%，其在MM与非肿瘤骨髓组织的表达差异有统计学意义，提示MDM2蛋白与MM的发生可能有一定关系。MDM2蛋白与MM不同临床分期的相关系数r=0.389，P<0.05，可以认为MDM2蛋白表达与MM的临床分期密切相关，随着分期的增加，其阳性率增高，提示MDM2蛋白与MM预后相关，阳性率越高，其预后越差。本组实验结果与Sugano等[14]的研究结果一致，进一步证实了MDM2基因在恶性肿瘤的发生、发展过程中起重要作用。

苗海港等[15]应用免疫组化法对脂肪瘤和原发性腹膜后脂肪肉瘤组织中c-myc蛋白及MDM2蛋白表达进行检测，发现c-myc蛋白及MDM2蛋白在原发性腹膜后脂肪肉瘤中高表达，且c-myc蛋白与MDM2蛋白的表达呈正相关，提示在脂肪肉瘤的发生、发展中两者可能具有协同作用。本组60例MM中c-myc蛋白与MDM2蛋白表达呈正相关，提示在MM的发生、发展中，c-myc和MDM2蛋白可能具有协同作用，两者可共同促进肿瘤的发展。有关c-myc和MDM2基因共同作用于MM促进其发生、发展的分子机制尚不清楚，有待进一步实验研究。

综上所述，c-myc和MDM2蛋白表达与MM的发生、发展密切相关，联合检测c-myc和MDM2蛋白可能作为MM辅助诊断、判断预后的依据，同时也可能成为临床治疗的有效靶点。

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Expression of c-myc and MDM2 protein in multiple myeloma and their clinical significance

ZHAO Zhi-hua, TIAN Yan, CHEN Kui-sheng

(DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Henan450052,China)

Purpose To investigate the expression of c-myc and MDM2 protein in multiple myeloma (MM) and their correlation with clinical stage. Methods Immunohistochemical SP three-step method was used to detect the expression of MDM2 and c-myc protein in 60 cases of MM with different clinical stages and 10 cases of nontumorous bone marrow tissue. Results The positive rate of c-myc protein in MM and nontumorous bone marrow tissue were 71.7% and 10.0%; the positive rate of MDM2 protein in two tissues were 80.0% and 20.0%, respectively. The expression difference of two proteins between MM and nontumorous bone marrow tissue was statistically significant (P<0.05). The expression of c-myc and MDM2 protein was positively correlated with MM clinical ISS stage (P<0.05), but irrelevant with the age and gender. The expression of c-myc and MDM2 protein in MM was positively correlated (P<0.05). Conclusion The c-myc and MDM2 protein have a highly expression in MM, and it may be relative to the occurrence of MM and clinical stage. In the MM, c-myc and MDM2 protein may have synergetic functions and promote the development of tumor.

bone neoplasms; multiple myeloma; c-myc protein; MDM2 protein; clinical stage

时间：2017-2-27 10:14

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170227.1014.024.html

河南省高等学校重点科研项目(17A310036)

郑州大学第一附属医院病理科，河南 450052

赵志华，男，硕士生导师，副教授。E-mail: 13598868878@163.com 陈奎生，男，硕士生导师，教授，通讯作者。E-mail: 15036607301@163.com

R 733.3

A

1001-7399(2017)02-0165-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.02.011

接受日期：2016-10-28