CK、Ki67、Gly-3及P53在肝细胞癌组织中的表达

邹柯涵，徐 敏，罗书笛，邹国英，任碧琼(.湖南省妇幼保健院病理科，湖南 长沙 40008；.湖南省第二人民医院病理科、检验科，湖南 长沙 40007)

CK、Ki67、Gly-3及P53在肝细胞癌组织中的表达

邹柯涵1，徐 敏2，罗书笛2，邹国英2，任碧琼2
(1.湖南省妇幼保健院病理科，湖南 长沙 410008；2.湖南省第二人民医院病理科、检验科，湖南 长沙 410007)

目的 探讨细胞角蛋白（CK）、核抗原（Ki67）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Gly-3）及抑癌基因P53在肝细胞癌（HCC）组织中的表达。方法 收集16例肝细胞肝癌患者癌组织及癌旁组织，采用免疫组化染色技术，分别检测CK、Ki67、Gly-3及P53，分析其表达情况。结果 免疫组化检测16例HCC癌组织中CK7、CK8/18、CK19的阳性率分别为50%（8/16）、93.8%(15/ 16)以及62.5%（10/16），Ki67的阳性率为75%（12/16），Gly-3阳性率为87.5%（14/16），P53的阳性率为50%（8/16）。结论HCC患者癌组织中CK、Ki67、Gly-3及P53的表达有不同程度的上调，其中以CK8/18阳性率最高，Gly-3及Ki67次之，P53 及CK7相对较低。

肝细胞癌；免疫组化；细胞角蛋白；Ki67；Gly-3；P53

我国原发性肝癌患者数量占全球54%，好发于男性，高发年龄为30～50岁[1-2]，每年死于肝癌的人数达37万。肝细胞癌 （hepatocellular carcinoma, HCC)是原发性肝癌中最常见的一种，占原发性肝癌的90%以上。与肝内胆管细胞癌 (HICC)和肝细胞癌-肝内胆管细胞癌混合型等其它病理类型的原发性肝癌相比，HCC的发病机制、生物学行为、组织形态、临床表现、治疗方法以及预后等方面均有其明显的特点，因此，了解HCC组织中表达的肿瘤相关蛋白及分子的表达有利于HCC的诊断及治疗。

随着免疫组织化学染色技术的应用和不断发展，越来越多的肿瘤相关分子的检测可以在临床开展[3-4]，近期推出的一系列肿瘤相关蛋白特异性免疫组织染色为肝癌等恶性疾病的诊断提供新的方向。本文初步报道肝癌患者癌组织中的细胞角蛋白7、 8/18、19、Ki67、Gly-3以及P53突变基因的表达，为各种指标的进一步应用提供实验依据。

1 对象和方法

1.1 对象

收集湖南省第二人民医院病理科2015年1月至2016年12月的外科手术切除的HCC患者癌组织标本16例及癌旁组织16例。病人资料见表1。

1.2 方法

组织首先用10%的甲醛固定，然后切取肿瘤组织按脱水、透明、浸蜡、包埋程序处理，4 μm连续切片，首先进行苏木素-伊红(HE)染色，肝癌诊断由病理专业两位副主任医师复诊，按Edmondson-Steiner法确定肝癌分化程度。

1.3 免疫组化检测

表1 HCC患者基本信息及病理资料

采用EnVision 2步法，切片经过烤片、脱蜡，乙醇由高至低浓度至入水，pH 6.0柠檬酸缓冲液中高温高压修复上气后加热2 min，蒸馏水冲洗，3%过氧化氢液10 min，PBS缓冲液洗涤 3遍，每遍3 min，加羊血清37℃封闭10 min，PBS缓冲液洗3遍，每遍3 min，加一抗(鼠抗人单克隆抗体，试剂盒提供的工作液)，37℃ 2 h，PBS清洗3遍，每遍3 min，加入二抗37℃ 30 min，PBS缓冲液浸 3遍，DAB显色，蒸馏水冲洗，复染，封片。CK19需在高温高压修复后，37℃进行1 min胃酶消化，PBS缓冲液洗3遍，加入一抗（试剂盒提供的工作液)。

1.4 仪器与试剂

免疫组化采用Leica BOND全自动免疫组化及原位杂交染色系统。CK、Ki67及P53试剂为仪器配套试剂；Gly-3试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.5 染色结果判断

CK、Gly-3在细胞质中表达，Ki67、P53在细胞核中表达。阳性染黄色或棕黄色。评价标准为：细胞阳性率＜10%判定为阴性(-)；细胞阳性率10%～30%为弱阳性(+)；细胞阳性率31%～60%为阳性(++)；细胞阳性率＞60%为强阳性(+++)。

2 结果

2.1 HCC组织及癌旁组织HE染色

结果见图1。

2.2 CK7、CK8/18、CK19的表达

16例HCC患者癌组织中CK7阳性表达8例，阳性表达率为50.0%，癌旁组织仅1例弱阳性表达,阳性率为6.25%，二者差异有显著统计学意义（P＜0.01）；16例 HCC患者癌组织中CK8/18阳性表达15例，阳性表达率为93.8%，癌旁组织仅2例阳性表达，阳性率12.5%，二者差异有显著统计学意义（P＜0.01）；16例HCC患者癌组织中CK19阳性表达10例，阳性表达率为62.5%，癌旁组织全部无表达，二者差异有显著统计学意义（P＜0.01），染色阳性及阴性结果见图2。

图1 癌组织及癌旁组织光镜图（HE×400）

图2 CK7、CK8/18及CK19在HCC组织中的表达（免疫组化法×100）

2.3 Ki67、Gly-3及P53的表达

16例HCC患者癌组织中Ki67阳性表达12例，阳性表达率为75%，癌旁组织2例阳性表达，阳性率12.5%，二者差异有显著统计学意义（P＜0.01）；16例HCC患者癌组织中Gly-3阳性表达14例，阳性表达率为87.5%，癌旁组织全部无表达，二者差异有显著统计学意义 （P＜0.01）；16例HCC患者癌组织中P53阳性表达8例，阳性表达率为50%，癌旁组织全部无表达，二者差异有显著统计学意义（P＜0.01），染色阳性及阴性结果见图3。

图3 Gly-3、Ki67及P53在HCC组织中的表达（免疫组化法×100）

3 讨论

细胞角蛋白（cytokeratin，CK）是角质细胞中的主要骨架蛋白，它作为一种中间丝存在于所有上皮细胞及部分非上皮细胞，以维持上皮组织的完整性及连续性，根据分子量大小将其分为30种基因型。角蛋白在上皮源性肿瘤疾病的发生发展过程中出现异常表达，因此可作为肿瘤的辅助诊断指标[5]，本研究发现不同的CK在HCC中有不同的表达率，CK8/18作为应激蛋白几乎在所有HCC组织中表达，癌旁组织也有不同程度的表达。不少研究表明CK7可以作为结直肠癌、原发性卵巢肿瘤以及肝癌等肿瘤细胞转移的标志物[6-7]，但本研究的结果显示CK7表达相对较低。CK19表达与细胞分化程度呈负相关[8]，表达CK19的肝癌侵袭性及恶性程度更严重[9]，本研究中有60%以上的HCC表达CK19，但未做进一步临床分析。

细胞增殖核抗原Ki67定位于细胞核，在细胞增殖周期中表达，G0期缺如，G1期时即可检测出，可提示机体细胞增殖情况。Ki67的表达上调促进肿瘤细胞增殖，对其深入研究对于了解肿瘤的生物学行为和预后有重要价值[10-13]。Ki67标记的是处于增殖周期中的细胞。该标记阳性率越高，肿瘤生长越快，组织分化越差，对化疗也越敏感。一般来说，预后较差。本研究中Ki67在HCC患者癌组织中的表达阳性率为75%。

Gly-3是通过糖基磷脂酰肌醇锚连接到细胞表面的肝磷脂蛋白聚糖的磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的成员[14]，Gly-3在细胞增殖和在特定组织中的细胞凋亡诱导作用中具有负面作用[15]。然而，它在HCC中过表达最近也有报道[16-17]，与本研究结果相符。

P53是位于染色体17的短臂上的肿瘤抑制基因，通常调节细胞周期机制的活性。已观察到p53基因的突变在多种类型的人类癌症中具有高流行性，并且经常伴随点突变发生。研究报道HCC中p53突变的频率在18%至67%之间[18]，p53突变蛋白阴性患者为肝癌发生的早期，在肝癌发生的中期检测到突变型p53蛋白，这表明p53突变是启动细胞恶性转化的关键因素[19]。本研究中的p53表达阳性率为50%，准备扩大样本与结合临床资料进行分析。

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（本文编辑 马 薇）

Expression of CK,Ki67,Gly-3 and P53 in Hepatocellular Carcinoma Tissues

ZOU Kehan1，XU Min2,LUO Shudi2,ZOU Guoying2,REN Biqiong2
(1.Department of Pathology,Maternal and Child Health Hospital of Hunan Province,Changsha,Hunan 410008,China;2.Department of Pathology and Clinical Laboratory,the Second People's Hospital of Hunan Province,Changsha,Hunan 410007,China)

Objective To investigate the expression of cytokeratin (CK),nuclear antigen (Ki67),Gly-3 and P53 in hepatocellular carcinoma (HCC).Methods CK,Ki67,Gly-3 and P53 were detected by immunohistochemical staining technique in 16 patients with hepatocellular carcinoma (HCC)respectively.Results The positive rates of cytokeratin 7,cytokeratin 8/18 andcytokeratin 19 in HCC tissues were 50%(8/16),93.8%(15/16)and 62.5%(10/16),respectively.The positive rate of Ki67,Gly-3 and P53 were 75% (12/16),87.5% (12/16),and 50% (8/16),respectively.Conclusion The expression of CK, Ki67,Gly-3 and P53 were up-regulated in HCC patients,with the highest positive rate of CK8/18,followed by Gly-3 and Ki67.The expression of P53 and CK7 were relatively low in HCC patients.

hepatocellular carcinoma;immunohistochemistry;CK;Ki67;Gly-3;P53

R735.7

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.03.025

2016-12-09

邹柯涵，女，病理医师，E-mail：727266645@qq.com。

本文引用：邹柯涵，徐 敏，罗书笛，邹国英，任碧琼.CK、Ki67、Gly-3及P53在肝细胞癌组织中的表达[J].湖南中医药大学学报，2017，37（3）：326-328.