复方地黄合剂及复方逍遥合剂中黄芩苷含量测定

张德静+牛小彩

摘 要 目的：建立复方地黄合剂及复方逍遥合剂中黄芩苷含量的测定方法。方法：采用高效液相色谱（HPLC）法、C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、流速1.2 ml/min，柱温25 ℃，波长280 nm测定，流动相为乙腈-0.2%磷酸溶液（27∶73）。结果：在不同中药制剂中，黄芩苷峰形良好，方法专属性强。在浓度为16～320 μg/ml范围内均呈良好的线性关系（r=0.999 3）；在50%、100%、150%的浓度下，二制剂中黄芩苷的回收率分别为99%及97%，RSD分别为1.7%和1.6%。此外，黄芩苷在8 h内含量变化的RSD分别为0.3%和0.2%，稳定性良好。结论：该方法简便、准确、灵敏度高、重复性好，可用于复方地黄合剂及复方逍遥合剂中黄芩苷的含量的测定。

关键词 复方地黄合剂 复方逍遥合剂 黄芩苷 HPLC

中图分类号：R927.2； R286 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2017）05-0066-05

Determination of baicalin content in both compound Dihuang and compound Xiaoyao oral solutions

ZHANG Dejing*， NIU Xiaocai

（Department of R&D， Shanghai Meiyou Pharmaceutical Co. Ltd.， Shanghai 201423， China）

ABSTRACT Objective： To establish a method for the determination of baicalin content in both compound Dihuang and compound Xiaoyao oral solutions. Methods： The established HPLC method was carried out on a C18 column at detection wavelength of 280 nm with a mobile phase consisted of acetonitrile-0.2% phosphoric acid solution （27 ： 73）. Results： The peak shape of baicalin in different preparations of traditional Chinese medicine and the specificity of the method were good. The standard curve of baicalin showed a good linear relationship over the range of 16- 320 μg/ml （r=0.999 3）. The average recoveries were 99% with RSD 1.7% for compound Dihuang oral solution and 97% with RSD 1.6% for compound Xiaoyao oral solution under the concentrations of 50%， 100%， 150% of original ones. Besides， the RSD of baicalin content change was 0.3% and 0.2% in 8 hours of storage， indicating its good stability. Conclusion： This method is convenient and accurate with high sensitivity and good reproducibility， can be used to determine the content of baicalin in both compound Dihuang and compound Xiaoyao oral solutions.

KEY WORDS compound Dihuang oral solution； compound Xiaoyao oral solution； baicalin； HPLC

黃芩苷（baicalin）是从黄芩根中提取分离出来的一种黄酮类化合物，具有显著的生物活性，具有降压、镇静、保肝、利胆、抗菌、消炎、抗肿瘤等作用和生理功效[1-2]，在临床医学已占有重要地位。各种药物制剂，如双黄连口服溶液、柴黄口服溶液、芩桑化痰颗粒、复方地黄合剂、复方逍遥合剂等，均含有黄芩苷，且黄芩苷含量作为药品质量控制的关键项目。因此，黄芩苷含量的测定方法至关重要。

根据文献查阅，黄芩苷含量测定方法较多，如薄层扫描法[3]、薄层-紫外法[4]、紫外分光光度计法[5]、HPLC法[6]、高效毛细管电泳法等[7]，各种方法均存在一定的优劣性[8-9]，如耗时长、操作复杂等。本研究建立了新的黄芩苷含量的测定方法，有利于复方地黄合剂及复方逍遥合剂的质量控制。

1 材料和方法

1.1 仪器

Agilent 1200型高效液相仪（美国安捷伦公司）；Thermo U3000型高效液相仪（赛默飞世尔科技有限公司）；Waters 2695型高效液相仪（沃特世科技有限公司）；电子天平（型号BS124S，赛多利斯）。

1.2 样品与试剂

复方地黄合剂和复方逍遥合剂（上海美优制药有限公司，批号150102、150102）；黄芩苷对照品（中国药品生物制品检验所，批号1107515-201318）。

乙腈及甲醇（色谱纯，默克公司）；磷酸和乙醇（分析纯，永华化学科技（江苏）有限公司）；蒸馏水（自制）。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

精密量取样品2 ml，置50 ml容量瓶中，加甲醇約30 ml，超声处理10 min，放冷后加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品溶液。精密称取黄芩苷对照品适量，用甲醇溶解并稀释成浓度为60 μg/ml的对照品溶液。

按照复方地黄合剂和复方逍遥合剂的配方，剔除中药饮片黄芩，模拟生产工艺分别制备复方地黄合剂和复方逍遥合剂的空白样品；依次精密移取空白样品2 ml，分别置50 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀作为复方地黄合剂和复方逍遥合剂的空白对照溶液。各取9份空白溶液2 ml，均置于50 ml容量瓶中，将浓度为2 mg/ml对照品溶液1、2和3 ml分别加入各三份空白溶液中，加入甲醇定容，摇匀，滤过，取续滤液作为准确度测试加样供试品溶液。

1.3.2 色谱条件

采用高效液相色谱法，C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），波长280 nm，流动相为乙腈-0.2%磷酸溶液（27∶73），流速1.2 ml/min，柱温25 ℃，进样量20 μl。

1.3.3 线性和范围

精密称取黄芩苷对照品适量，置100 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为320 μg/ml对照品贮备液，依次稀释制备成浓度梯度为240、160、80和16 μg/ml的5个标准溶液。分别注入液相色谱仪（Agilent 1200）测定并记录色谱图。

1.3.4 方法验证

1）专属性 取空白对照溶液、供试品溶液以及对照品溶液各20 μl，分别注入高效液相色谱仪（Agilent 1200）测定并记录色谱图。另取复方地黄合剂及复方逍遥合剂的供试品溶液各20 μl，注入高效液相色谱仪（Waters 2695），采用PDA检测器，测定并记录色谱图。

2）准确度 取准确度测试加样供试品溶液进样测定并记录色谱图。

3） 重复性 取两种制剂的供试品溶液各6份进样测定并记录色谱图（Agilent 1200）。

4）中间精密度 由不同试验人员将供试品溶液注入不同液相色谱仪（Agilent 1200、Thermo U3000）测定并记录色谱图，观察黄芩苷含量的变化。

5）溶液稳定性 分别在0、1、2、4、6和8 h进样（Agilent 1200）测定，以0 h峰面积为准，计算复方地黄合剂和复方逍遥合剂的供试品溶液在8 h内峰面积的变化。

6）耐用性 取供试品溶液20 μl进样（Agilent 1200），通过改变柱温、流速及流动相比例，考察其对含量测定的影响。条件如下：①乙腈-0.2%磷酸溶液=27∶73、流速1.2 ml/min，柱温分别为20、25和30 ℃；②乙腈-0.2%磷酸溶液比例分别为25∶75、27∶73及21∶79，柱温25 ℃、流速1.2 ml/min；③乙腈-0.2%磷酸溶液=27∶73、柱温25 ℃，流速分别为1.0、1.2和1.4 ml/min。

2 结果

2.1 线性和范围

在16～320 μg/ml的浓度范围内，以黄芩苷浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，求得线性方程为y=0.926 5x -3.144 5，相关系数r=0.999 3，表明在该浓度范围内，线性符合规定。

2.2 专属性

在1.3.2的色谱条件下，黄芩苷主峰保留时间为7.82 min，空白对照溶液在黄芩苷主峰的相应位置无干扰峰出现，供试品溶液与对照品溶液黄芩苷主峰的保留时间一致（图1）。PDA检测结果角度值均小于阈值，表明黄芩苷色谱峰仅为单一成分在280 nm波长下的响应值，含量测定方法专属性强。

2.3 准确度

在相对于样品50%、100%、150%不同浓度下，复方地黄合剂及复方逍遥合剂中黄芩苷的平均回收率分别为99%和97%（表1），RSD分别为1.7%和1.6%，回收率良好。

2.4 重复性

复方地黄合剂和复方逍遥合剂供试品溶液各6份含量测定的RSD分别为1.6%和0.4%（表2），RSD小于2%，表明具有较好的重复性。

2.5 中间精密度

由不同操作人员、采用不同色谱系统测定，复方地黄合剂和复方逍遥合剂中黄芩苷含量测定结果RSD小于2.0%，黄芩苷中间精密度良好（表3）。

2.6 溶液稳定性

在0～8 h内，黄芩苷峰面积相对稳定，复方地黄合剂及复方逍遥合剂中黄芩苷峰面积变化的RSD分别为0.3%和0.2%（表4），均小于2%，说明稳定性良好。

2.7 耐用性

对于流动相比例、柱温和流速的考察表明，改变色谱条件时，黄芩苷色谱峰的理论板数均大于2 000，黄芩苷主峰与相邻峰分离度均大于1.5，发现最佳色谱条件为：流动相为乙腈-0.2%磷酸溶液（27∶73），流速1.2 ml/min，柱温25 ℃。

3 讨论

在流动相选择方面，乙腈具有溶剂强度较高，黏度较小，其截止波长190 nm 比甲醇205 nm更短，更適合末端吸收进行黄芩苷含量的检测。本研究中色谱检测流动相有机溶剂为乙腈，结果表明在该流动相下，黄芩苷主峰与邻近峰分离度良好，峰形理想。在黄芩苷萃取及样品制备方面，常采用溶剂为乙醇及甲醇，经超声及加热回流可高效完成有效成分的萃取。经过PDA检测，黄芩苷在280 nm波长下仅为单一色谱峰，故选择检测波长280 nm。方法学验证结果表明，该方法具有简单、快捷、专属性强、灵敏度高、耐用性好的特点，适用于含黄芩苷的中药以及制剂的含量测定。

与其它研究[6]相比，本研究明显缩短了黄芩苷的测定时间，提高了工作效率，扩大了该方法的应用范围。本研究与2015版中国药典[10]关于药品质量标准分析验证指导原则相一致。然而，鉴于中药制剂成分的复杂性，本方法仅为黄芩苷含量的测定提供参考。

参考文献

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