黄芪黄酮干预脾虚水湿不化大鼠血浆代谢组学研究

刘阿娜 赵文晓 巩丽丽 于瑞雪 崔宁 陈迩东

摘要采用高效液相色谱结合飞行时间质谱检测正常大鼠、脾虚水湿不化证大鼠及黄芪黄酮组分干预后大鼠血浆内源性代谢物变化，获取大鼠血浆代谢图谱，研究黄芪黄酮组分干预脾虚水湿不化证的作用机制。采用高脂低蛋白饮食加负重游泳力竭建立脾虚水湿不化证大鼠模型，选择HaloC18色谱柱，流动相为0.05%甲酸水与0.05%甲酸乙腈，梯度洗脫，利用液相色谱串联质谱分析测定大鼠血浆样品。利用主成分分析法对造模前后大鼠血浆样本进行代谢轮廓分析，结合变量投影重要性及显著性分析等筛选对分组贡献最大的差异标志物及相关通路，阐明药物的作用机制。结果表明，黄芪黄酮组代谢轮廓异于模型组，而接近于正常组，共鉴定出了包含甘油磷脂类、鞘酯类、氨基酸类等在内的11种潜在生物标志物，其代谢通路包括三羧酸循环、甘油磷脂代谢、脂肪酸代谢及氨基酸代谢等，主要涉及体内能量代谢和脂肪代谢。黄芪黄酮干预脾虚水湿不化证大鼠后，宏观指标（如体重、自主活动）和微观指标（如代谢标志物、血脂）均明显回调，表明黄芪黄酮可能主要通过调节能量代谢、脂肪代谢等途径而发挥健脾利水作用。

关键词黄芪黄酮；脾虚水湿不化证；代谢组学；高效液相色谱飞行时间质谱

1引言

黄芪为临床传统用药，始载于《神农本草经》，具有健脾补中，利水消肿等功效[1]。脾虚证是一组能比较集中反映脾各种生理功能不足表现的综合征候群，临床多采用益气健脾法治疗。黄芪为“补益脾气之要药”，故在临床上主要用于治疗脾虚发热[2]、脾虚肠易激综合征[3]及其它各种脾虚疾病[4]，但目前其药效的物质基础及作用机制尚不明确。

黄芪化学成分多而复杂，主要包括皂苷、黄酮及多糖类。近代药理研究结果表明，黄芪黄酮具有改善胃肠功能[5]促进水液代谢[6]、降低血脂、健脾[7]及抗肿瘤[8]等功效。本课题组前期研究结果也表明黄芪黄酮组分对脾虚水湿不化证大鼠一般状况、血脂等指标均有不同程度的治疗作用[9]，表明黄芪黄酮组分可能是黄芪发挥健脾利水作用的物质基础。

目前，文献报道的黄芪及其主要活性成分治疗疾病作用机制的研究几乎都是从药理作用及分子角度出发。近年来，随着代谢组学的快速发展[10～13]，越来越多的研究采用代谢组学方法阐释中药及复方药治疗脾虚证的机制。陈磊等[14]利用代谢组学方法研究了补中益气汤治疗脾虚的作用机制。但目前尚无从黄芪黄酮等活性成分角度对治疗脾虚水湿不化证的作用机制进行研究的代谢组学研究报道。本研究从代谢组学角度出发，利用高效液相色谱飞行时间质谱结合模式识别技术分析鉴定了黄芪黄酮组分干预前后脾虚水湿不化证大鼠血浆内源性代谢物，初步探讨黄芪黄酮组分治疗脾虚水湿不化证的作用机制，为进一步研究黄芪健脾利水的物质基础及深入探寻其作用机制提供科学依据。

2实验部分

2.1仪器与试剂

Agilent1260高效液相色谱（美国AgilentTechnologies公司），配有在线真空脱气机、四元泵、柱温箱和检测器；Agilent6230飞行时间质谱仪（美国AgilentTechnologies公司），配有ESI离子源和在线MassHunter数据采集处理系统；VORTEXGENIE2涡旋仪（美国SI公司）；凯特TD5A离心机（盐城凯特实验仪器有限公司）。乙腈、甲醇（色谱纯，美国Merck公司）；甲酸（色谱纯，美国Tedia公司）；实验用水为超纯水，由美国Millipore公司的MilliQ系统制得。

2.2实验动物

健康Wistar大鼠30只，体重（150±20）g，雌雄各半，购自鲁抗医药集团股份有限公司实验动物中心（许可证编号SCXK鲁20130001）。

2.3实验药物

黄芪黄酮组分制法及含量测定：采用传统水煎煮法，浓缩液经80%乙醇沉淀，取上清液回收至无醇味，乙酸乙酯萃取，制备黄芪黄酮组分。HPLCPDA含量测定，色谱柱为ZORBAXSBC18柱（250mm×4.6mm，5μm，美国Agilent公司）；流动相A：乙腈，B：0.1%甲酸，流速：0.5mL/min，线性梯度洗脱：0～10min，5%A；10～30min，5%～40%A；30～60min，40%～70%A；60～70min，70%～100%A。进样量：10μL，PDA检测波长：254nm。结果测得毛蕊异黄酮含量7.78mg/g，毛蕊异黄酮苷含量4.88mg/g，芒柄花苷含量3.80mg/g，芒柄花素含量4.79mg/g。

2.4大鼠造模方法，评价指标及分组给药

Wistar大鼠适应性饲养1周，随机分为正常组（10只，雌雄各半）和实验组（20只，雌雄各半）。正常组以纯化饲料饲养，实验组依据《中药治疗脾虚证的临床研究指标原则》和《中医湿病学》[15，16]釆用“饮食失节（高脂低蛋白饮食）+劳倦过度（负重游泳）”复合因素诱导，建立脾虚水湿不化证大鼠模型，按毛色、体重消瘦、自主活动等指标评分，评价模型。造模成功[6]后将实验组随机分为模型组与黄芪黄酮组（每组各10只，雌雄各半），黄芪黄酮组根据2015版药典成人日服黄芪最高剂量（30g/70Kg）及等效剂量系数折算法换算[17]，给予大鼠黄芪黄酮提取物0.07g/kg，正常组与模型组给予等量生理盐水，每天灌胃给药1次，连续2周。实验过程中各组老鼠出现死亡（正常组1只（雄性），模型组2只（1雄1雌），黄芪黄酮组2只（2雌）），造模结束后25只老鼠纳入代谢组学实验用。

2.5血浆样品的采集与处理

大鼠行腹腔麻醉，腹主动脉取血，肝素钠抗凝，离心15min，上清液于 80℃保存。分析前血浆样本室温解冻，准确吸取300μL，加入600μL甲醇，涡旋1.5min，4000r/min离心15min，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后分析。

2.6实验方法

2.6.1色谱条件色谱柱为HaloC18柱（100mm×2.1mm，2.7μm，美国AdvancedMaterialsTechonology公司），经色谱条件优化，流动相A为0.05%甲酸，B为0.05%甲酸乙腈。梯度洗脱：0～10min，90%～70%A；10～20min，70%～40%A；20～28min，40%A；28～30min，40%～36%A。进样量5μL，流动相流速为0.3mL/min，柱温25℃。

2.6.2质谱条件采用ESI源，正离子模式，干燥气温度350℃，干燥气流速10L/min，毛细管电压4000V，雾化气压力为35psi，碎裂电压140V，质荷比扫描范围：m/z50～1000。选取m/z121.050873和922.009798作为参比离子。

2.7代谢组学数据處理与分析

2.7.1数据质量评价所有血浆样本取100μL，等量混合，制成质控（Qualitycontrol，QC）样本，处理方法同血浆样品。样品检测前进样5次QC样本，使系统平衡。每隔6个样品插入一个QC样本进行检测，将获得的QC样本数据矩阵进行数据分析，观察QC样品聚类效果从而评估数据质量。

2.7.2数据处理原始质谱数据采用ProteoWizard（http：//proteowizard.sourceforge.net/）软件转换成“.mzXML”格式，利用XCMS处理软件进行峰识别、峰校准、滤噪和数据简化处理。将包含化合物保留时间、质荷比信息与峰强度的结果以“.csv”格式导入Metaboanalyst3.0（http：//www.metaboanalyst.ca）网络分析平台进行主成分分析（Principalcomponentsanalysis，PCA）和偏最小二乘判别分析（Partialleastsquaresdiscriminantanalysis，PLSDA），用各组变量投影重要性参数（Variableimportancefortheprojection，VIP）筛选潜在的生物标志物，筛选出VIP>1[18]的变量以xls格式导入到MassProfilerProfessional软件（美国Agilent公司，MPP）中进行AnalysisofVariance（ANOVA）分析，筛选p<0.05的变量。本实验将VIP>1、p<0.05的代谢物作为候选的潜在生物标志物。通过检索HMDB（http：//www.hmdb.ca）、METLIN（https：//metlin.scripps.edu）、KEGG（http：//www.genome.jp/kegg/）数据库，同时参照文献及质谱鉴定结果而确定标志物结构。

3结果与讨论

3.1一般状况

正常组大鼠反应敏捷，体肌健壮，摄食正常。

模型组大鼠与正常组相比表现出自主活动降低（p<0.01）、皮毛干枯、蓬乱、光泽度降低、体重下降（p<0.01）等状况，

表明造模成功。而与模型组相比，黄芪黄酮组大鼠神倦乏力、体重（p<0.01）、自主活动（p<0.01）等能量代谢宏观指标均有改善，表明黄芪黄酮组分对脾虚水湿不化证有一定的治疗作用。

3.2血浆样品的分离与分析

图1为各组大鼠及QC样本正离子模式下的总离子流图，各组色谱峰保留时间基本一致，同一时间色谱峰高度有差别，表明3组大鼠体内的代谢模式发生变化。但图中某些色谱峰的保留时间发生漂移，需要进行数据预处理。

3.3数据质量评价

QC实验数据导入MetaboAnalyst3.0软件进行主成分分析，QC数据间聚类紧密，并集中分布于95%可信区间内，表明数据质量可靠。为进一步验证数据质量的可靠性，从QC样本中选取质量数从低到高的10个离子（离子信号用m/z与保留时间（min）表示，计算结果显示各离子的RSD值<3%）见表1，说明数据可靠。

3.4数据结果分析

无监督PCA方法对正常组与模型组大鼠之间的差异进行统计学分析。PCA得分图（图2A）中模型组与正常组明显分离，表明两组大鼠血浆代谢模式发生变化。为进一步寻找3组之间的差异变量，利用PLSDA进行有监督的模式识别，PLSDA得分图（图2B）中3组组内聚类紧密，组间区分良好，黄芪黄酮组位于两组之间且趋向于正常组，表明给予黄芪黄酮组分后，脾虚水湿不化证大鼠血浆代谢模式趋向正常。为增加结果准确性、评判模型的有效性以及防止过度拟合现象，对PLSDA模型进行排列检验，结果见图2C。在建立的模型中，原始值R2Y=0.949，Q2=0.872，说明模型的拟合能力和预测能力良好（R2Y表示模型的拟合能力，Q2表示模型的预测能力），50次随机排列后R2和Q2的截距为0.225，-0.378（排列检验对应的R2和Q2的截距应各小于0.3，0.05[19]），R2和Q2两者皆在规定范围内，表明所建模型无过度拟合。

〖PS07402.eps，BP#〖TS（〖HK38〖HT5”SS

图2（A）正常组、模型组PCA得分图；（B）3组PLSDA得分图；（C）代谢组学模型排列检验法的可靠性验证结果

3.5潜在标志物的鉴定

查询HMDB，METLIN和KEGG数据库，并与质谱图数据及文献＼[20～22＼]进行比对，3组共有11种内源性代谢产物具有显著性差异（p<0.05），见表2。与正常组相比，模型组中乳酸、磷脂酰胆碱、〖CM（44溶血磷脂酰胆碱、鞘磷脂、甘油磷酸胆碱含量升高，而苯丙氨酸、甜菜碱、丙氨酸、鞘氨醇及缬氨酸含量〖CM）

模型组vs正常组，T/M：黄芪黄酮组vs模型组p<0.05，p<0.01↑上调；↓下调。

M/N：Modelgroupvsnormalgroup，T/M：flavonoidsofAstragalusgroupvsmodelgroup，p<0.05，p<0.01↑up；↓down.[BG）W][HT5][HJ]

下降（p<0.05，p<0.01）；黄芪黄酮组与模型组相比11种内源性代谢物含量发生不同程度的回调（图3），表明黄芪黄酮组分对脾虚水湿不化证有一定的治疗作用。实验鉴别出的代谢产物，联系其相关的代谢通路，构建了相关代谢网络示意图。

3.6标记物代谢通路分析

脾虚水湿不化证模型大鼠血浆中乳酸含量升高，见图3F。乳酸在机体内的代谢途径大致有两条：一是完全氧化为CO2和H2O供能，二是通过糖异生途径转化为葡萄糖，上述两条代谢途径皆需要氧气[23]。本实验模型组中乳酸含量显著高于正常组，可能是由于对氧的利用率下降所致。陈磊等[14]研究发现乳酸在脾虚证模型大鼠脾臟中也具有同样的变化趋势。黄芪黄酮组分干预后大鼠血中乳酸含量下调，表明黄芪黄酮组分可能通过纠正低氧状态而发挥治疗作用。

苯丙氨酸、缬氨酸及丙氨酸皆为生糖氨基酸。在体内酶的作用下缬氨酸分解产生琥珀酰辅酶A。苯丙氨酸在酶的作用下先生成酪氨酸，后者体内继续分解代谢最终形成乙酰乙酸和延胡索酸，丙氨酸参与体内丙氨酸葡萄糖循环途径，在脱氨酶的作用下生成丙酮酸，亦可转化为葡萄糖储存能量[23]。相关代谢物的代谢网络示意图如图4所示，3种氨基酸的代谢产物为三羧酸循环代谢底物。本实验模型组大鼠体内3种氨基酸含量下调（见图3H，J和K），表明脾虚大鼠体内氨基酸代谢紊乱而间接导致能量代谢功能下降[22]，黄芪黄酮组分干预后，3种氨基酸水平回调，表明黄芪黄酮组分干预脾虚水湿不化过程中通过调节体内氨基酸水平而间接调控三羧酸代谢发挥治疗作用。

溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰胆碱、甘油磷脂酰胆碱三者皆属于胆碱类化合物。三者在体内能够促进脂肪燃烧[24]。实验过程中，高脂低蛋白饮食造成大鼠脾虚证候，致饮食减少[6]，糖摄入及运化不足，导致糖分解供能障碍。机体为维持基本生命活动，代偿性动员脂肪分解供能[24]，脂肪分解供能过程中体内上述胆碱类物质含量上调（见图3A，B和E），但过度动员导致体内脂肪代谢紊乱[24]。杨宇峰等[21]在利用代谢组学研究脾肾气虚证时发现，患者血浆中溶血磷2脂酰胆碱与正常组相比有上调的趋势，与本研究结果一致。黄芪黄酮组分干预后，大鼠脾虚症状缓解，饮食增加，能量代谢恢复，不再代偿性分解脂肪。胆碱类物质在干预后下调，表明黄芪黄酮组分通过健脾利水作用，恢复能量代谢而使脂肪代谢恢复正常。

棕榈酰肉碱（图3D），体内长链脂酰CoA与肉毒碱结合转化为脂酰肉毒碱（如棕榈酰肉碱）进入线粒体内膜，实现脂肪酸在线粒体内进行β氧化，为机体供能[25]。甜菜碱（图3I），体内可由胆碱转化而来[25]。甜菜碱作为一种甲基供体，可为甲基化产物肉碱提供甲基，促进肉碱合成。本实验中模型组大鼠体内脂肪代谢活跃，导致肉碱含量被动增加，故棕榈酰肉碱含量升高，而甲基供体的甜菜碱含量下调。这可能与脾虚导致的运化水谷精微减少相关，体内代偿性分解脂肪，故棕榈酰肉碱含量升高，而甜菜碱含量下调[26]。黄芪黄酮组分干预后，糖代谢恢复正常，脂肪动员减弱，棕榈酰肉碱在大鼠体内含量下调，而甜菜碱含量上调。

综上所述，脾虚水湿不化证大鼠代谢组学研究表明，疾病大鼠体内能量代谢、脂肪代谢、氨基酸代谢等微观指标代谢异常，这与前期疾病大鼠体重、自主活动等宏观指标研究结果相符[9]。黄芪黄酮组分可能通过调节上述代谢通路发挥健脾利水作用，使脾虚水湿不化证大鼠宏观指标恢复正常，上述代谢组学研究结果表明，黄芪黄酮组分确为黄芪药材健脾利水的药效成份之一。

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AbstractAmethodofhighperformanceliquidchromatographycoupledwithtimeofflightmassspectrometrywasusedtodetecttheendogenousmetaboliteschangesinplasmaofnormalrats，ratsofdampnessstagnancyduetospleendeficiencyandAstragalusflavonecomponentinterventionrats.MetabolismmapofratplasmawasobtainedandthemechanismofAstragalusflavonoidsondampnessstagnancyduetospleendeficiencywasstudied.Ratmodelwithdampnessstagnancyduetospleendeficiencywasestablishedbyhighfatandlowproteindietplusloadswimming.Liquidchromatographytandemmassspectrometrywasusedfortheanalysisofratplasmasample，and0.05%formicacidwaterwith0.05%formicacidacetonitrileasthemobilephasewasappliedingradientelutionwithHaloC18chromatographiccolumn.Inthisstudy，partialleastsquaresdiscriminantanalysisandvarianceanalysiswereusedtoscreenthepotentialbiomarkers，itwasfoundthatthemetabolicprofileoftheAstragalusflavonoidswasdifferentfromthatofthemodelgroup，whichwasclosetothatofthenormalgroup.Atotalof11potentialbiomarkerswereidentified，includingglycerolphospholipids，sphingolipids，aminoacids，andsoon.Themetabolicpathwaysofbiomarkersincludingthreetricarboxylicacidcycle，glycerolphospholipidmetabolism，fattyacidmetabolism，aminoacidmetabolismandsoon，whichmainlyrelatedtoenergymetabolismandfatmetabolisminthebody.RelatedindexesofratswithsyndromeofspleendeficiencyofwateranddampnessweresignificantlycallbackafterAstragalusflavoneintervention，includingmacroindicatorssuchasbodyweight，independentactivitiesandmicroindicatorssuchasmetabolicmarkers，bloodlipidsandothers.TheresultshowedthatAstragalusflavonoidsplayedtheroleofstrengtheningthespleenanddrainingthewatermainlythroughregulatingtheenergymetabolism，fatmetabolismandsoon.

KeywordsAstragalusflavonoids；Dampnessstagnancyduetospleendeficience；Metabolics；Highperformanceliquidchromatographytimeofflightmassspectrometry

（Received5October2016；accepted9December2016）

ThisworkweresupportedbytheNationalBasicResearchProgramofChina（Nos.2013CB5318000）.