6种黄酮协同抗氧化作用及构效关系研究

肖星凝 徐雯慧 左 丹 廖 霞 明 建,2

(1. 西南大学食品科学学院，重庆 400715；2. 重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400715)

6种黄酮协同抗氧化作用及构效关系研究

肖星凝1徐雯慧1左 丹1廖 霞1明 建1,2

(1. 西南大学食品科学学院，重庆 400715；2. 重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400715)

以ABTS+·清除能力为指标，采用Chou-Talalay中效原理设计试验，研究6种结构不同的小分子黄酮协同抗氧化作用及构效关系。结果表明：6种黄酮化合物对ABTS+·清除能力依次为：5,6,7-三羟基黄酮>6-羟基黄酮>3,7-二羟基黄酮>5-羟基黄酮>3-羟基黄酮>7-羟基黄酮>抗坏血酸，其中5,6,7-三羟基黄酮、6-羟基黄酮和3,7-二羟基黄酮氧化作用效果显著；在不同浓度下，两种黄酮复配物对ABTS+·清除能力的联合作用指数CI值有较大差异；3,7-二羟基黄酮和其它5种黄酮都有明显的协同作用。充分说明6种黄酮化合物之间的协同抗氧化作用与化合物的羟基位置和数量有关，具有C3,7-二羟基是协同抗氧化作用的主要结构特点。

黄酮；抗氧化；构效关系；相互作用；中效原理

黄酮类化合物是一类在植物界广泛分布，具有酚羟基的两个苯环(A环和B环)通过一个三碳链相互连结而成的化合物[1]。依据C3是否呈环及其氧化程度和B环的连接位置等特点可将黄酮类化合物分为7个子类，即黄酮、类黄酮、黄酮醇、异黄酮、花色素、黄烷醇和查耳酮[2]。大量研究[3-5]表明，黄酮类化合物具有多种生理功能和药用价值，如抗氧化、保护心脑血管、抗骨质疏松作用、抗菌消炎、抗辐射和抗肿瘤等，其中最引人注目的是其抗氧化作用。据报道[6]，黄酮类化合物与其它抗氧化化合物(如单宁)的协同效应可能是物质高抗氧化活性的主要原因。

黄酮类化合物发挥其抗氧化作用主要是通过不同途径防御引起机体氧化损伤的自由基，因而其抗氧化作用与其组分、结构或聚合度都有密切关系[7]。当前也有研究[8]涉及分析其结构与抗氧化性的关系，但对黄酮类化合物协同抗氧化作用与构效关系研究相对较少，仍需要进一步深入。然而食物中的抗氧化物质发挥抗氧化作用往往是协同发挥作用的，但关于各种不同的黄酮之间如何发挥协同作用方面的研究还很少。本试验拟选用3-羟基黄酮、5-羟基黄酮、6-羟基黄酮、7-羟基黄酮、3,7-二羟基黄酮和5,6,7-三羟基黄酮6种结构不同的小分子黄酮作为研究对象，以抗坏血酸为对照，测定其抗氧化活性，并研究不同结构黄酮两两复配后抗氧化活性的变化及怎样复配才能产生协同抗氧化效应，以探讨抗氧化性与黄酮类化合物中取代基羟基的位置和数量的内在联系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

3-羟基黄酮、5-羟基黄酮、6-羟基黄酮、7-羟基黄酮、3,7-二羟基黄酮、5,6,7-三羟基黄酮、ABTS：生化试剂，美国Sigma公司；

其他试剂：分析纯，成都科龙化工试剂公司。

1.2 仪器与设备

电子天平：FA2004型，上海恒丰科学仪器有限公司；

恒温水浴锅：HH-4型，金坛市易晨仪器制造有限公司；

分光光度计：JH722型，上海精科科学仪器厂；

电热恒温鼓风干燥箱：DHG-9140A型，上海齐欣科学仪器有限公司；

恒温磁力搅拌器：85-2A型，金坛市科析仪器有限公司；

超声波清洗器：KQ3200DE型，昆山市超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 ABTS+·清除率测定 根据文献[9]，修改如下：将ABTS用2.45 mmol/L过硫酸钾溶液溶解，配成7 mmol/L ABTS储备液，在室温、避光条件下静置12～16 h。将生成的ABTS+·溶液用磷酸盐缓冲液(PBS，10 mmol/L，pH 7.4)稀释至室温下734 nm处吸光值为0.70±0.02，即得到ABTS+·工作液。将6种黄酮用无水乙醇配置浓度分别为5，10，15，20，30，40，50，60 μmol/L的溶液。反应体系中，于10 mL试管中加入1 mL不同浓度的样品液和3 mL ABTS+·工作液，混合均匀后30 ℃水浴反应6 min，以抗坏血酸为对照，无水乙醇为空白，测定反应液在734 nm处的吸光值m1，按式(1)计算样品的ABTS+·清除率。然后计算出清除50% ABTS+·的浓度(IC50)。

(1)

式中：

c——ABTS+·清除率，%；

m1——样品液吸光度；

m0——空白样吸光度。

1.3.2 抗氧化相互作用试验设计 根据6种黄酮化合物各自的IC50值，分别配置浓度为0.1，0.25，0.5，0.75，1.0，1.25，1.5倍IC50值的溶液。两个黄酮化合物复配，各个浓度均以等体积比混合均匀[如：0.5 mL 0.5(IC50)的化合物1与0.5 mL 0.5(IC50)的化合物2混合]，测定ABTS+·清除率。

1.3.3 化合物联合作用指数分析 采用中效原理计算[10-12]。两化合物联合作用指数的公式为：

(2)

式中：

(D)1——化合物1与别的化合物联合作用产生X效应时所需的浓度；

(D)2——化合物2与别的化合物联合作用产生X效应时所需的浓度；

(Dx)1——化合物1单用产生X效应时所需的浓度；

(Dx)2——化合物2单用产生X效应时所需的浓度。

与苏教版相比，康轩版的编排顺序主要有3个方面的不同．其一，康轩版安排的5个活动是“同分母分数相除”“整数除以分数”“异分母分数相除”“有余数的除法”及“关系”，分数除法类型与苏教版不同，其每一个活动内的例题基本按照除数是真分数、假分数、带分数（大陆小学数学教材一般不涉及带分数）除法呈现．其二，不同类型的分数除法的算法是统一的，即都化成相同单位的分数进行计算，在此基础上引导学生发现除以一个数等于乘这个数的倒数的规律．其三，安排了“有余数的分数除法”．两种版本编排顺序上的差异反映出编写者对知识逻辑结构理解的差异．

通过CI值可以定量判断不同化合物间相互作用的性质以及强度(表1)。衡量相互作用以平均CI值(Weighted Average CI，CIwt)表示，公式为：

(3)

式中：

CI50——在EC50(作用达到50%时的浓度)时的CI值；

CI75、CI90、CI95同理。

表1 化合物联合作用的平均CI值区间及相互作用评价Table 1 The range of CI and description in compound combination studies

1.3.4 统计分析 每个试验重复3次，结果用“平均值±标准差”表示，使用Excel 2010进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 6种黄酮的ABTS+·清除率

根据ABTS+·溶液前后吸光度的变化可测定样品抗氧化能力[13]。3-羟基黄酮、5-羟基黄酮、6-羟基黄酮、7-羟基黄酮、3,7-二羟基黄酮、5,6,7-三羟基黄酮6种黄酮化合物ABTS+·清除率测定结果见图1，其IC50值分别为：17.40，14.82，9.39，35.11，10.79，9.05 μmol/L，对照品抗坏血酸的IC50值为46.21 μmol/L，则其活性大小依次为：5,6,7-三羟基黄酮>6-羟基黄酮>3,7-二羟基黄酮>5-羟基黄酮>3-羟基黄酮>7-羟基黄酮>抗坏血酸。IC50越低，表明对 ABTS+·的清除能力越强，反之则越弱。综合比较，6种黄酮化合物对 ABTS+·清除能力均强于抗坏血酸，其中5,6,7-三羟基黄酮清除能力最强，6-羟基黄酮较弱于5,6,7-三羟基黄酮，而3,7-二羟基黄酮，5-羟基黄酮，3-羟基黄酮，7-羟基黄酮显著弱于5,6,7-三羟基黄酮，其中7-羟基黄酮最弱。

2.2 6种黄酮两两复合物的抗氧化活性

由表2可知，当两种黄酮组合时，除了“5-羟基黄酮与3,7-二羟基黄酮”“6-羟基黄酮与3,7-二羟基黄酮”“3,7-二羟基黄酮与5,6,7-三羟基黄酮”3组以外，其他12个组合联合作用时对ABTS+的清除效果都弱于它们单独作用的。“5-羟基黄酮与3,7-二羟基黄酮”和“6-羟基黄酮与3,7-二羟基黄酮”在浓度小于0.75(IC50)时，联合作用的清除率是小于两个单独作用或其中某一个单独作用，大于0.75(IC50)时，则比单独作用时效果都好。“3,7-二羟基黄酮与5,6,7-三羟基黄酮”则是从0.5(IC50)浓度开始联合作用效果超过单独作用。

图1 6种黄酮化合物ABTS+·清除率(IC50值)Figure 1 ABTS radical scavenging rates (IC50) of Six Different Flavonoids

表3是用中效原理算出各化合物联合作用时的平均CI值，从表3中可看出，3,7-二羟基黄酮和其它5种黄酮联合作用时都有或强或弱的协同作用(轻微协同，中等协同，协同)，与5-羟基黄酮、6-羟基黄酮和5,6,7,-三羟基黄酮联合作用时，其CIwt为0.6～0.7，表现为协同作用，与7-羟基黄酮联合作用时，CIwt为0.806，表现为中等协，与3-羟基黄酮联合作用时CIwt为0.850，表现为轻微协同。6-羟基黄酮与5,6,7-三羟基黄酮组合时，CIwt为0.9～1.1，存在相加作用，而与其他黄酮(除3,7-二羟基黄酮以外)联合作用时一般表现拮抗作用，与3-羟基黄酮表现为轻微拮抗，与5-羟基黄酮和7-羟基黄酮表现为中等拮抗。此外，表现为中等拮抗作用的还有5-羟基黄酮和5,6,7-三羟基黄酮中等拮抗，剩下的为拮抗。总体上，没有出现强协同/拮抗或非常强协同/拮抗的组合。

抗氧化协同作用机理主要有修复再生、偶联氧化、吸收氧气、改变酶的活性、络合金属离子5大类[16]。许多研究证实多种抗氧化剂联合使用效果往往要大于单一抗氧化剂的使用效果[17]，但是并非所有的抗氧化剂联合使用就一定有很好的协同效果，还存在一些影响因素，如还原电位、相对浓度、反应体系[18]。大多数情况下，在一个特定的比例，协同效应达到最高水平[19]。汤晓等[20]认为黄酮间的协同或拮抗可能需要在氧化压力环境下才被激发。马燕妮等[21]比较研究桑叶黄酮与鬼针草黄酮组分体外协同抗氧化活性时，表明在总黄酮量相同的情况下，分别提取后混合在一起对羟自由基的清除效果优于混合提取，其原因可能是两种原料放在一起提取，其中的化合物会发生相互反应，从而使黄酮类成分含量减少。从本试验也可看出单体黄酮的浓度和结构对协同作用有一定影响。

表2 两化合物组合对ABTS+·清除率和浓度的关系Table 2 The relationship of ABTS+· clearance and concentration of two compounds in combination

表3 两化合物复配清除ABTS+·的CI值Table 3 The CI Value of two compound combinations on scavenging ABTS+·

2.3 黄酮协同抗氧化构效关系

6种黄酮化合物的化学结构见图2，其不同点在于羟基数目和位置，这两者是影响其抗氧化活性的重要因素。Wolfe等[22]曾报道B环具有苯邻二酚基团的黄酮类和黄酮醇类化合物才有细胞抗氧化活性，其中具有3′,4′-邻羟基基团具有很强的细胞抗氧化活性(CAA)，而5′-羟基基团降低CAA值，C-环结构中，2,3-双键、3-羟基基团、4-酮基基团均对CAA很重要。与单体相比，黄酮混合物的协同抗氧化所涉及的构效关系更为复杂。Hidalgo等[23]认为黄酮混合物抗氧化的协同作用与拮抗效果，可能与黄酮之间的氢键缔合有关。Abou Samra等[24]研究表明，如果2种黄酮均有3’,4’-二羟基结构，混合后容易生成邻二苯醌结构，其抗氧化活性会受到较强抑制。汤晓等[25]报道含有较多B环羟基的黄酮类化合物更易发生拮抗作用，可通过调节黄酮单品的比例减小混合物的拮抗作用或增强其协同作用。4-羰基与C2=C3对黄酮化合物抗氧化协同或拮抗作用的影响要大于3′,4′-邻二羟基，而3′,4′-邻二羟基的影响则大于B环仅有一个羟基的结构[26]。

图2 6种黄酮结构Figure 2 The structure of six flavonoids

由试验结果发现，3,7-二羟基黄酮和其它5种黄酮联合作用时都有或强或弱的协同作用(轻微协同，中等协同，协同)。其中，与5-羟基黄酮、6-羟基黄酮、7-羟基黄酮和5,6,7,-三羟基黄酮联合作用表现为较强的协同作用，而与3-羟基黄酮却表现出轻微协同作用关系。可以看出A环上的C5,6,7位羟基比B环上的C3位羟基具有较强的协同作用，与3,7-二羟基黄酮具有较好的协同清除ABTS+·的效果；说明A环的C5—OH、C6-OH、C7-OH是高抗氧化活性基团结构，这与Wolfe等[22]的研究结果基本一致。此外，单个羟基和3个羟基数目的黄酮之间均表现出拮抗作用(除6-羟基黄酮与5,6,7-三羟基黄酮表现出轻微相加作用外)。充分说明C3,7-二羟基是几种黄酮协同抗氧化活性主要结构特点。

3 结论

6种黄酮化合物对ABTS+·清除能力依次为：5,6,7-三羟基黄酮>6-羟基黄酮>3,7-二羟基黄酮>5-羟基黄酮>3-羟基黄酮>7-羟基黄酮>抗坏血酸，影响其抗氧活性主要因素是羟基化的程度和羟基的位置，但并非羟基取代基越多其抗氧化活性相对越强。对于6种黄酮化合物两两复合物协同抗氧化，化合物的结构和浓度会影响复配后协同作用效果，本研究表明C3,7-二羟基是几种黄酮协同抗氧化活性主要结构特点，但是否通用于其它结构类型黄酮有待进一步研究。对于两黄酮化合物之间相互作用机制还有待于研究。本试验只采用一种抗氧化方法对其抗氧化和协同抗氧化活性进行评价，在后续的研究中可以结合其它抗氧化活性评价方法，如细胞抗氧化活性和动物试验等，进而全面评价其抗氧化活性和协同抗氧化作用，探索构效关系，为抗氧化功能性食品配料的科学筛选提供依据。

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The synergistic antioxidant effect and structure-activity relationship of six flavonoids

XIAO Xing-ning1XUWen-hui1ZUODan1LIAOXia1MINGJian1,2

(1.CollegeofFoodScience,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China; 2.ChongqingEngineeringResearchCenterofRegionalFood,Chongqing400715,China)

In this study, the ABTS free radicals scavenging activity was as an indicator, the Chou-Talalay method was used to investigate the synergistic antioxidant effect and structure activity relationship of six kinds of small molecules with different structures. The results showed that the ABTS free radicals scavenging activity of the six kinds of flavonoids was in following order, i.e., 5,6,7-trihydroxy flavone > 6-hydroxyl flavone > 3,7-dihydroxy flavone > 5-hydroxy flavone > 3-hydroxy flavone > 7-hydroxyl flavone > ascorbic acid. Among them, 5,6,7-trihydroxy flavone, 6-hydroxy flavone and 3,7-dihydroxy flavone oxidation effect significantly, under different concentration and two flavonoid compounds on ABTS free radicals scavenging activity of the combined effect of CI values are quite different, dihydroxy flavone and other five kinds of flavonoids have obvious synergistic effect. It was also found that the synergistic antioxidant effects of the six flavonoid compounds were related to the position and quantity of the hydroxyl group, the main structural feature of the synergistic antioxidant effect of 3,7-dihydroxy.

flavone; antioxidant; structure-activity relationship; interaction; Chou-Talalay method

国家自然科学基金面上项目(编号：31471576)；重庆市特色食品工程技术研究中心能力提升项目(编号：cstc2014pt-gc8001)；重庆市社会民生科技创新专项(编号：cstc2015shmszx80019)

肖星凝，女，西南大学在读本科生。

明建(1972—)，男，西南大学教授，博士。 E-mail：mingjian1972@163.com

2016—12—29

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.02.004