蜂胶可吸收成分及其特征单体抑制心肌细胞凋亡实验研究

周 威,张奇峰,徐 凯,许红梅,程清洲

(武汉轻工大学 医学技术与护理学院,湖北 武汉 420023)

蜂胶可吸收成分及其特征单体抑制心肌细胞凋亡实验研究

周 威,张奇峰,徐 凯,许红梅,程清洲

(武汉轻工大学 医学技术与护理学院,湖北 武汉 420023)

观察蜂胶可吸收成分及其特征黄酮单体对阿霉素诱导大鼠心肌细胞凋亡模型的保护作用。从大鼠灌胃蜂胶提取物及其特征单体白杨素、高良姜素30 min后，腹主动脉取血，离心制备含蜂胶及特征单体的血浆。提取SD大鼠乳鼠心肌细胞并培养，采用阿霉素制备心肌细胞凋亡模型；将制备的蜂胶及白杨素、高良姜素的血浆与心肌细胞混合，使用缺口末端标记法(TUNEL法)进行心肌细胞凋亡检测。实验结果表明，蜂胶提取物、白杨素、高良姜素组可吸收成分心肌组织细胞凋亡率与模型组比较显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；蜂胶提取物组效果较好，蜂胶可吸收成分具有心肌细胞保护作用，减轻阿霉素诱导的心肌损伤。

蜂胶;可吸收成分;心肌细胞凋亡;白杨素;高良姜素

1 引言

蜂胶(propolis)是蜜蜂从植物幼芽与树干上采集的树胶与其上颚腺分泌物和蜂蜡等混合加工而成的一种具有芳香气味的胶状固体物。它主要由蜂胶香脂、蜂蜡、树脂、花粉等组成[1-2]。近年来国内外已有研究资料表明，蜂胶及其制剂具有良好的心肌保护作用[3-4]；但现有资料的研究主要集中在蜂胶(包括复方)原料及不同提取物、单体等对不同的体外细胞的作用，未显示有蜂胶可吸收成分及其中的特征黄酮对心肌的保护作用及其细胞、分子机制的研究。本实验研究是在大鼠灌服蜂胶可吸收成分及其特征单体白杨素、高良姜素一段时间后，以灌服后的吸收成分为研究对象，以阿霉素造乳鼠心肌细胞损伤模型[5]，探讨蜂胶对心肌细胞的保护作用。

2 实验仪器及材料

KQ-500DE型超声波清洗器(江苏昆山超声仪器公司)；RE- 52AA旋转蒸发仪(上海亚荣公司)。凯达TGL-20LM台式高速冷冻离心机(湖南凯达科学仪器公司)；CO2培养箱(长沙华曦电子科技有限公司)；倒置相差显微镜CK-40(Olympus，Japan)；全自动洗板机(北京普朗新技术有限公司)。注射用盐酸阿霉素(浙江海正药业股份有限公司(批号140412))；白杨素(Lot：130402)和高良姜素(Lot：120815)均购自北京盛世康普化工技术研究院，纯度以HPLC≥98%。健康SD雄性大鼠(华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，许可证号为SCXK(鄂)2004-0007)。实验用蜂胶为本课题组前期批次所购，经陈平(武汉轻工大学生物及制药工程学院)教授鉴定，由武汉市小蜜蜂有限公司提供，采自湖北省神农架林区[6]。

3 实验方法

3.1 蜂胶中白杨素及高良姜素含量测定

蜂胶提取物按文献[7]方法进行制备，并根据2010版药典一部蜂胶项下含量测定中高效液相测定方法[8]，对提取物中白杨素、高良姜素含量进行测定。精密称取提取物适量，加10倍量甲醇超声提取2次，每次20分钟，过滤并定容；精密称取白杨素及高良姜素对照品，定容。选用色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Eclipse XDB-C18 保护柱。以甲醇-0.15%磷酸溶液(64:36)为流动相，检测波长为268 nm。连续测定5次。

3.2 含蜂胶血浆的制备

称取蜂胶提取物、白杨素、高良姜素，加入食用酒精(95%)，润湿浸泡，超声提取2次，抽滤。根据2010版药典[8]成人剂量0.2—0.6 g/ 60 kg，折算成大鼠给药剂量，取SD 大鼠灌胃剂量为60 mg/kg，并通过蜂胶提取物中白杨素、高良姜素的含量计算灌胃剂量。大鼠随机分生理盐水、蜂胶提取物、白杨素、高良姜素给药，每只大鼠每日2次，连续7 天，对照组给以同剂量的生理盐水。末次灌胃前禁食12 h。末次灌胃45 min后，腹主动脉采血，静置，3000 r/min 离心分离血浆，置- 20 ℃保存备用[9]。

3.3 心肌细胞的分离提取

参照文献[10]方法，取出生 1—3 天的 SD 大鼠乳鼠，无菌条件下开胸，取出心脏，浸入预冷的盛有PBS 的培养皿中，转入超净台中操作，去除血管、心房、结缔组织及残留的血液，剪成碎块，加入含胰酶和EDTA的消化液， 37 ℃水浴锅中重复消化，制成细胞悬液，200 目尼龙网过滤，收集滤液，1000 r/min，离心5 min。弃上清，加入含13%FBS 的 DMEM 完全培养基10 ml，接种于培养瓶中，置培养箱培养后接种到细胞板中，细胞生长情况，每2天换液。

3.4 原位末端转移酶标记法(TUNEL)检测心肌细胞凋亡实验研究

根据文献[11]方法，将3.3提取的心肌细胞纯化后接种于六孔板中，用含15%小牛血清的DMEM的常规完全培养液培养，每24小时换液一次，72小时后加入药，对照组只加入常规完全培养液，模型组加入含阿霉素的完全培养液，药物组分别添加：蜂胶血浆、白杨姜素血浆、高良姜素血浆及含阿霉素的完全培养液。放置各组细胞于培养箱中培养，在药物作用48小时后取出各组细胞爬片，多聚甲醛固定，按照试剂盒说明书操作，进行TUNEL细胞凋亡染色后置显微镜下观察。每张切片在荧光显微镜(100倍镜)下随机选取10个视野，观察凋亡细胞，计算凋亡指数。凋亡指数=心肌凋亡细胞数/总心肌细胞数×100%[12]。

4 结果

4.1 白杨素及高良姜素含量测定结果

高效液相图谱如图1所示。

1.高良姜素；2.白杨素；3.蜂胶提取物图1 蜂胶提取物及白杨素、高良姜素对照品液相图谱

通过图1可知，在液相条件下白杨素、高良姜素能达到良好分离。建立对照品浓度-峰面积曲线，通过线性关系考察、精密度测试、稳定性试验均达到要求。测试结果表明，白杨素浓度为(15.26±0.72)%；高良姜素浓度为(7.11±0.37)%。

4.2 心肌细胞凋亡试验(TUNEL法)

心肌凋亡主要图谱如图2所示。

图2 心肌细胞凋亡试验结果

根据观察及计算结果，各组间凋亡指数如表1所示。

组别凋亡值(%)正常组0%∗◆模型组83．02±4．23◆蜂胶组46．07±2．47∗白杨素组71．26±3．27∗◆高良姜素组73．37±4．02∗◆

注：标“*”代表与模型组有显著性差异(P<0.05)；标“◆”代表与蜂胶组有显著差异(P<0.05)。

从结果可知，阿霉素能明显使心肌细胞产生凋亡；蜂胶提取物及白杨素、高良姜素可吸收成分对阿霉素引起的心肌细胞凋亡有缓解作用；但蜂胶组效果明显优于白杨素及高良姜素(P<0.05)。TUNEL标记定位于心肌细胞核，凋亡阳性细胞呈棕褐色，细胞核固缩。观察时正常心肌细胞有节律性搏动，大部分细胞搏动一致，细胞立体感明显，多呈长梭形，且有分支或突起，细胞有互相聚集的趋势；阿霉素处理模型组绝大部分细胞呈凋亡状态，细胞内丝状的肌原纤维明显可见；蜂胶组、白杨素组、高良姜素等组有凋亡细胞，但相对模型组比数量上有差异，且有部分状态良好的细胞，可见其明显搏动。

5 讨论

根据已有文献及本课题组前期的研究成果，蜂胶具有良好的心肌保护作用。本研究分析了大鼠灌胃蜂胶提取物、白杨素、高良姜素一段时间后取出的血浆对体外培养的心肌细胞凋亡影响。从实验结果可知，蜂胶提取物可吸收成分能明显改善阿霉素引起的心肌细胞凋亡；白杨素、高良姜素对阿霉素引起的心肌细胞凋亡有部分改善作用，但弱于蜂胶提取物可吸收成分，说明蜂胶提取物可吸收成分具有较好保护心脏作用；而药典中作为液相检测指标性成分的白杨素与高良姜素的心脏保护作用弱。蜂胶对心脏的保护作用不能以白杨素、高良姜素来衡量，其保护心肌成分还来源于蜂胶其他成分。

蜂胶作为一种具有明显保护心脏作用的天然药物和保健食品，其有效核心成分及其保护心脏作用机制研究和功能产品开发具有深远意义。在整体动物实验基础上，配合含药血浆的体外实验，在探究营养物质的作用机制、途径及功效方面，是一种较好的研究方案，值得在今后的天然药物和保健食品研究开发中推广应用。

[1] 瞿永华,周威,李伟,等.蜂胶提取物对小鼠肝脑组织SOD、GSH-Px、MDA影响的实验研究[J].辽宁中医杂志,2013,40(5):1018-1019.

[2] Bankova V,Boudourovakrasteva G,Popov S,et al.Seasonal variations of the chemical composition of Brazilian propolis[J]．Apidologie,1998,29(4):361-367．

[3] 隋玲娟,刘义.辽西蜂胶醇提取物与槲皮素对培养心肌细胞过氧化损伤保护作用的比较研究[J].世界临床药物,2008,29(1):37-40．

[4] 马士巧,马海乐,潘忠礼,等.黑蜂蜂胶不同极性提取物的体外抗氧化活性[J].中国食品学报,2016,16(8):53-58．

[5] 潘跃银,徐淑萍,魏伟.尼美舒利与阿霉素联合应用对肝癌HepG2 细胞增殖及凋亡的影响[J].中国药理学通报,2006,22(7):884-887．

[6] 程清洲,瞿永华,周威,等.鄂西产蜂胶提取物的抗衰老作用[J].中国医院药学杂志,2013,33(8):662-663．

[7] 周威,程清洲,陈新,等.浙江桐庐产蜂胶中黄酮类化合物研究[J].中华中医药杂志,2013,28(2):394-397．

[8] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典[S].北京:中国医药科技出版社,2010.

[9] 张奇峰,周威,尹美珍,等.蜂胶可吸收成分对胰岛细胞的作用[J].中国医院药学杂志,2013,33(7):1390-1392．

[10] 贺抒,谢晓芳,张雪,等.附子水溶性生物碱对心衰细胞模型的治疗作用[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(16):127-131．

[11] 张志升,杨东艳,张蕾,等.沉默CrkL对缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡和生存力的影响及其机制[J].第二军医大学学报,2014,35(11):1272-1276．

[12] 陈佳,曹智勇,何永辉,等.水飞蓟素通过抑制心肌细胞凋亡减轻心肌梗死[J].第二军医大学学报,2015,36(12):1309-1313.

Research on inhibition on cardiomyocyte apoptosis by absorbable compounds of propolis and its characteristic compounds

ZHOUWei,ZHANGQi-feng,XUKai,XUHong-mei,CHENGQing-zhou

(School of Health Science and Nursing,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China)

To observe the effect on protection on cardiomyocyte apoptosis of mice induced by adriamycin cells by absorbable compounds of propolis and its characteristic flavonoid compounds. The rats were perfused with extract of propolis and its characteristic flavonoids: Chrysin and galangin. After 30 min, blood were collected from abdominal aorta and prepared different centrifuged plasma:extract of propolis, Chrysin and galangin. Extracted ventricular cells from suckling mice and cultivated, then prepared cell model of extract of propolis by adriamycin. Mixed different plasma: normal, extract of propolis, Chrysin and galangin with cells, then used Terminal dUTP Nick End Labeling (TUNEL) method to do detection of cardiomyocyte apoptosis. Result shows that group of extract of propolis, Chrysin and galangin can more obviously decrease the rate of cardiomyocyte apoptosis than that of model group, with statistical significance(P<0.05); the group of extract of propolis shows the best effect.Adsorbable element of propolis can significantly protect ventricular cells,and alleviate damage of ventricular cells caused by adriamycin.

Propolis; adsorbable elements; extract of propolis; Chrysin ; galangin

2017-01-10.

周威(1973-),男,副教授,博士,E-mail:491321959@qq.com.

程清洲(1966-),男,副教授,硕士,E-mail:chqz5758@sina.com.

湖北省自然科学基金项目(2015CFC844).

2095-7386(2017)01-0044-04

10.3969/j.issn.2095-7386.2017.01.009

R 542.2

A