基于葡聚糖硫酸钠造模法研究溃疡性结肠炎发病机制的进展

庄志奇, 黄 彪, 吴巧凤

成都中医药大学针灸推拿学院, 成都 610075

基于葡聚糖硫酸钠造模法研究溃疡性结肠炎发病机制的进展

庄志奇, 黄 彪, 吴巧凤*

成都中医药大学针灸推拿学院, 成都 610075

葡聚糖硫酸钠造模法是研究溃疡性结肠炎的重要方法。因其操作简单、经济实惠且造模成功率高，在科学研究中被广泛应用。从肠道通透性增加、肠道屏障被破坏、细胞因子改变、信号通路异常和肠道菌群失调5个方面对葡聚糖硫酸钠诱发的溃疡性结肠炎的相关研究进展进行了总结和探讨，并对其未来的研究方向和思路进行了展望。

葡聚糖硫酸钠；溃疡性结肠炎；造模现状；机制研究

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种非特异性的、病因尚不十分清楚的、发生在结肠和直肠的慢性炎症性疾病，主要症状是腹泻、便血、腹痛、里急后重等，且反复发作、病程漫长，给患者带来极大痛苦。据流行病学调查结果，UC的发病率在世界范围内呈逐年升高的趋势。目前UC造模的方法众多，有醋酸法、三硝基苯磺酸(trinitrobenzene-sulfonic acid,TNBS)法、葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium, DSS)诱导法等。醋酸诱导的UC模型的病理特点是急性炎症性反应，不能表现出人类的UC所具有的慢性、复发的特点。TNBS诱发的UC模型体现出急性炎症向慢性转化的动态过程，缺点是采用小剂量的TNBS诱导UC 时，炎症维持时间短、自愈性强，无慢性期变化；而采用大剂量的TNBS诱导UC时，动物死亡率高。DSS所致的UC简单易行、成功率高、重复性好，与人类的UC病变类似，反复用DSS刺激，可产生类似于人类UC的急性期和缓解期的变化，是较理想的人类UC模型，可应用于UC急性期与缓解期的研究，使实验能够完整地进行[1,2]，因此本文将重点对DSS所致的UC模型的相关研究进行探讨和分析。

1 DSS造模方法概述

DSS是一种由蔗糖合成的肝素样硫酸多糖体，具有抑制血液凝固、血小板聚集和增强血纤维蛋白溶解活性的作用。Ohkusa等[3]于1990年采用饮用的方法首次在小鼠中成功建立了该模型。目前研究发现DSS溶液浓度、分子量、饮用时间和动物品种等都会对DSS诱导UC模型产生影响。现在通常采用调整给药时间和给药频率的方法，以便分别构建急性和慢性两种结肠炎模型[1]。急性结肠炎模型常采用相对高浓度的DSS溶液、相对短的给药时间建立，如给予小鼠2%～5% DSS自由饮用4～7 d即可成功制成急性UC模型。慢性结肠炎模型则采用低浓度(0.5%～1%)DSS，给药3～6月。此外，慢性模型还可采用相对高浓度的DSS周期给药建立，如给予小鼠2.5%DSS自由饮用7 d，休息14 d，再给予相同浓度的DSS自由饮用7 d，如此反复2个周期即可建立慢性结肠炎模型[4～6]。模型成功后利用疾病活动指数进行评估，其症状主要包括腹泻、黏液样便、粪便潜血阳性、肉眼血便，同时，动物体质量下降、进食量减少、活动度减弱、毛色变差、贫血，甚至死亡等。在光镜和电镜下[6,7]，急性模型可看到结肠黏膜炎性细胞浸润、多发性糜烂、隐窝脓肿等急性炎症表现。慢性模型可见结肠粘膜不仅有糜烂、炎性细胞浸润，且有淋巴滤泡形成及粘膜再生改变，部分粘膜出现异型增生，同时可见肉芽组织增生和肿瘤样改变。

2 UC模型相关机制

2.1 肠道通透性增加

虽然UC 疾病的机制、临床症状不尽相同，但肠通透性增加是其共同特征，肠通透性增加的程度意味着肠道黏膜屏障受损的轻重，因此，肠道通透性实验是诊断UC 的重要依据之一[8]。DSS致UC模型相关研究发现，肠道通透性明显增加。与通透性相关的代谢离子通道，如氯离子通道(chloride channel,ClC-2)[9]、白细胞介素-33(interleukin-33)/ST2通道[10]等均发生异常改变，此外，与肠道通透性相关的基质金属蛋白酶MMP-9分泌异常，闭合蛋白的分布也发生变化[11]。有研究表明，这些变化可能与DSS所致的肠道粘膜微循环改变、肠上皮细胞凋亡增加[3]、肠内的营养失调[8]、大肠杆菌溶血素α分泌增多[12]以及肠道微生物失调密切相关。甚至有研究显示，DSS模型的肠道通透性增加可能还涉及到骨髓移位基因(myeloid translocation genes，MTG)中MTG16[13]和骨髓间充质干细胞的异常变化[14]等。

2.2 肠道屏障异常

肠道屏障最重要的是机械屏障功能，其结构基础为完整的肠粘膜上皮细胞以及上皮细胞间的紧密连接，许多疾病(包括UC在内的肠道损伤和炎症)的初始发生即为肠道屏障异常。其原因可能是上皮细胞功能缺失[15,16]，研究发现[16]，DSS致UC模型中动物肠上皮细胞的凋亡和扩散会导致肠道屏障异常。DSS诱导的UC促进白细胞介素18(interleukin-18，IL-18)的分泌，IL-18通过调节杯状细胞发育的转录程序抑制杯状细胞成熟，进而调控杯状细胞产生的保护性粘液和寄居微生物群，使肠壁变薄、通透性增加[17]。此外，DSS也会影响上皮细胞紧密连接蛋白如闭锁小带蛋白1(zonula occludens-1,ZO-1)、咬合蛋白(occludin)、钙黏蛋白(cadherin)、闭合蛋白(claudin)和β-连环蛋白(β-catenin)等的异常表达[18～20]。

2.3 炎症细胞因子的变化

2.3.1TNF-α 在DSS诱导的UC模型中，早期溃疡的形成是由黏附蛋白和杯状细胞粘蛋白对上皮细胞的损伤而致肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)增多所决定的[21]，TNF-α以旁分泌和自分泌的方式在肠黏膜局部发挥作用，并增强IL-1、IL-8等炎症因子的释放，扩大炎症连锁反应、增强局部炎症反应，从而造成肠黏膜的损伤。

2.3.2IFN-γ 在DSS诱导的UC模型中，γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)分泌增多，并诱导巨噬细胞、小胶质细胞和星形细胞产生诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，促进NO的合成，造成整个肠道氧含量的下降，肠低氧环境的形成将增加IL-1的转录与翻译，增强局部炎症反应。

2.3.3IL-1β IL-1β在DSS致UC模型中的表达升高，促进B细胞的分化和增殖，并刺激其他细胞因子和炎症因子的产生，加重肠道炎症。

2.3.4IL-10 IL-10在DSS所致的UC模型中含量降低，并且IL-10受体编码基因突变或者缺陷将导致炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)的发生，利用IL-10基因转化的大肠杆菌可明显缓解DSS小鼠的溃疡性结肠炎的炎症损伤[22]。表明IL-10具有重要的抗炎作用。此外，IL-10还能降低髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的活性、抑制炎症细胞NF-κB的活化及其他炎性细胞因子的分泌。

除上述炎症因子外， IL-17、IL-18、IL-6、IL-21、IL-25等在DSS 所致UC 模型中，对UC炎症的发生也起到促进作用；相反地，IL-4、IL-19、IL-22等在DSS 所致UC 模型中，则对UC炎症的发生起到重要的抑制作用。其他细胞因子，如血管内皮生长因子等，在DSS 所致UC 模型中也被证明有重要作用。

2.4 信号通路异常

2.4.1STAT相关信号通路 该通路中对UC影响最重要的因子是转录活化因子3(signal transducer and activator transcription 3,STAT3)。STAT3可通过介导炎症介质调控免疫细胞的生物学行为，是炎症形成过程中不可或缺的关键性分子[23]。而在UC 患者肠黏膜固有层的巨噬细胞和T细胞中存在着STAT3过度活化和功能紊乱的现象。在DSS所致的UC中，STAT3呈现出高表达。STAT 3通过多种途径参与溃疡性结肠炎的疾病发展过程，如IL-6/JAK/STAT 3通路、IL-21/STAT3通路等[24]。IL-6受体可形成IL-6/sIL-6R复合物, 继而活化细胞膜表面的糖蛋白130(gp130),激活与gp130相关的Janus激酶(Janus kinase,JAK)，活化酪氨酸激酶，诱导STAT3磷酸化。另一方面，NF-κB的激活能够促进IL-6的释放，IL-6的增加进一步扩大炎症反应，使炎症进一步加重。IL-21是免疫细胞分化和免疫功能所必需的I型细胞因子，IL-21可以诱导JAK1和JAK3的磷酸化，这又导致STAT3的磷酸化和核易位。可见，STAT3相关信号通路在DSS诱导的UC模型中占据了重要的地位。

2.4.2NF-κB NF-κB有明显抑制细胞凋亡的功能，是多条信号通路的汇集点，参与炎症的表达。研究发现，DSS诱导UC小鼠结肠粘膜的NF-κB 明显活化[25]，如IL-1/NF-κB通路、TNF-α/NF-κB通路和NF-κB/COX-2通路等。NF-κB活化后，可增强TNF-α和IL-1β的基因转录，使TNF-α和IL-1β的产生和释放增多，进而TNF-α和IL-1β再次激活NF-κB；NF-κB活化后还可使IL-6和IL-8的产生和释放增多，导致最初的炎症信号进一步放大。在细胞外也存在负反馈调节，如刺激NF-κB活化的因素TNF-α、IL-1β等也可导致反向调节细胞因子的产生。细胞外骨膜蛋白通过激活NF-κB 来调节肠道炎症[26]；同时表观遗传研究发现MicroRNA214激活NF-κB信号通路在UC的发病中扮演重要角色[27]。此外，如前所述，NF-κB的激活也会引起STAT3相关信号通路的激活。这为从信号通路方面治疗UC提供了有力的依据。

2.4.3Wnt相关信号通路 该通路调节肠上皮细胞的增殖、分化和凋亡，β-连环蛋白(β-catenin)是该通路中最关键的转录因子。研究发现在UC患者中检测到β-catenin升高；在DSS诱导的UC中，β-catenin被活化，通过多条通路参与到肠道炎症过程中，如Wnt /β-catenin/TCF信号通路、PI3K-Akt/mTOR/β-catenin信号通路等。β-catenin本身不能直接与DNA结合，需要与DNA结合蛋白TCF-4相互作用，在核内共同调控下游靶基因c-myc[28,29]的转录，诱导细胞恶变，从而完成Wnt信号的最终效应[30]。PI3K-Akt /mTOR[31]与细胞分化密切相关，该通路可诱导β-catenin磷酸化，引起肠上皮的增生。可见Wnt相关通路在DSS诱导的UC中发挥着重要的作用。

2.5 肠道菌群失调

肠道菌群失调是UC致病的关键因素[32,33]。例如，在DSS致UC中，Liu等[34]利用乳酸杆菌(Lactobacillus)能减轻UC症状；Low等[35]发现大肠杆菌(Escherichiacoli)在小鼠UC中有促致病的作用；张素真等[36]的研究发现，双歧杆菌(Bifidobacterium)通过诱导肠道上皮细胞(intestinal epithelial cells,IECs)中Toll样受体2(toll-like receptor 2,TLR2)的表达来抑制其TLR4、IL-1和TNF-α的表达, 从而达到预防与辅助性治疗DSS诱导的UC的作用；Chiu等[33]发现，脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)对DSS诱导的UC的内稳态和炎症反应起着重要调节作用。还有芽孢杆菌(Bacillusspp.)等菌群的失调对DSS所致UC也会产生重要的影响。本课题组多年的研究也显示，肠道微生态在DSS致UC模型中被破坏，降低肠道菌群的多样性以及有益菌群的含量，其中拟杆菌门和变形菌门细菌总含量下降，而厚壁菌门含量上升，乳酸杆菌、毛螺科菌和双酶梭菌也产生明显变化[37,38]。

3 展望

尽管目前采用DSS诱导的UC模型为深入探讨UC的机制取得了可喜的进展，但对于全面认识和防治UC仍存在不足，例如该模型在大小鼠等动物模型中较容易自愈，与人类疾病的发病过程还存在一些差异，今后是否可以将多种方法综合运用建立一种更接近人类疾病过程的模型值得探讨。此外，从机制研究上来看，UC本身的发病涉及到环境、遗传等多个方面，今后可进一步采用microRNA、表观遗传学、蛋白修饰等方法从环境与遗传相互作用的角度开展研究，也可以采用CRISPR/Cas等新技术直接深入到基因层次对与UC密切相关的GATA-3基因[39]、PTEN基因[40](gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN)和RASSF-1A基因[41](ras association domain family protein 1A)等进行研究。

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AdvancesinPathogenesisofUlcerativeColitisInducedbyDextranSulfateSodium

ZHUANG Zhiqi, HUANG Biao, WU Qiaofeng*

DepartmentofAcupunctureandTuina,ChengduUniversityofTCM,Chengdu610075,China

Dextran sulfate sodium (DSS)-induced ulcerative colitis is an important method to study ulcerative colitis. This method is widely used in scientific research due to its simple operation, affordable and high modeling success rate. This review summarized the mechanisms of ulcerative colitis induced by DSS, including increase of intestinal permeability, damage of intestinal barrier, cytokines disorder, abnormal signaling pathways and intestinal floras imbalance. Finally, future study directions and ways were prospected.

dextran sulfate sodium; ulcerative colitis; molding status; mechanisms research

2017-03-08;接受日期2017-07-03

国家自然科学基金项目(81373737)资助。

庄志奇，硕士研究生，研究方向为针灸治疗胃肠道疾病的机理研究。*通信作者：吴巧凤，研究员，博士，研究方向为胃肠道疾病的机理研究。E-mail：rwqfrwqf@163.com

10.19586/j.2095-2341.2017.0013