炮制方法对补骨脂中抗骨质疏松效应成分含量的影响＊

李 娜，颜冬梅＊＊，张金莲，高秀梅

（1. 江西中医药大学药学院 南昌 330004；2. 天津中医药大学中医药研究院 天津 300193）

炮制方法对补骨脂中抗骨质疏松效应成分含量的影响＊

李 娜1，颜冬梅1＊＊，张金莲1，高秀梅2

（1. 江西中医药大学药学院 南昌 330004；2. 天津中医药大学中医药研究院 天津 300193）

目的：探讨不同炮制方法对补骨脂中抗骨质疏松有效成分含量的影响。方法：采用HPLC法测定补骨脂生品及不同炮制品中香豆素类、黄酮类、单萜酚类抗骨质疏松效应成分的含量，对炮制前后三类成分的含量进行统计分析。结果：补骨脂经不同方法炮制后三类成分含量与生品相比均有极显著变化。结论： 药典收载的炮制法可同时提高三类化合物的含量，可能增强其治疗骨质疏松的作用，与中医认为“盐炙能增强温补脾肾的作用”的传统观念相吻合。

补骨脂 炮制 抗骨质疏松效应成分 影响

补骨脂为豆科植物补骨脂Psoralea corylifoliaL.的干燥成熟果实，其性温，味辛，具有补肾固精，缩尿止带，温脾止泻，固冲安胎之功效[1]。现代研究表明，补骨脂主要含有苯并呋喃苷、香豆素、黄酮、单萜酚类等成分[2]。在临床应用方面，历代医家广泛将其用于各类补肾健骨方中，治疗骨质疏松症[3，4]。现代药理研究显示，补骨脂可通过调节骨转化，促进成骨细胞增殖活性、抑制破骨细胞的重吸收，从而对骨质疏松起到一定防治作用[5-8]。本课题组前期研究显示，香豆素类、黄酮类和酚类化合物能激动ERα、ERβ受体[9]，而ERα与ERβ受体均参与了骨质的重建[10]。因此，三类化合物的含量高低将影响补骨脂在治疗骨质疏松症中的效应。

然而，南北朝刘宋时代的《雷公炮炙论》记载补骨脂“性本大燥，毒”，说明其虽有温肾助阳之功效，但不宜久服，入药均需经过炮制，至今临床所用补骨脂也均以炮制品为主，而补骨脂的炮制方法始载于《雷公炮炙论》：酒浸蒸以除燥毒[11，12]。后世医药学家在医疗实践中继承和发展了雷公法，发展出蒸、浸、炒、焙、煮、药汁制等多种炮制方法[13]。因此，补骨脂炮制品种较多，古今主要炮制方法包括雷公法、酒浸炒、清炒法、盐炙法、蒸法[14]。目前为止，对于炮制方法对补骨脂中不同类化学成分的影响，宋潇和王增绘等[15，16]对此做了一定工作，两者的研究均认为炮制能够改变补骨脂中效应成分的含量，但未充分解释治疗骨质疏松症的处方（如壮骨关节丸）选择盐炙品的原因。基于此，本实验拟采用HPLC法测定补骨脂炮制前后香豆素类（补骨脂素、异补骨脂素）、黄酮类（新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮、异补骨脂查耳酮、Corylifol A）和酚类（补骨脂酚）化合物的含量，比较不同炮制方法对补骨脂各类成分含量的影响，为各类炮制品的临床应用提供数据参考。

1 实验材料

DIONEX Ultimate 3000高效液相色谱仪，自带Ultimate 3000型自动进样器、 Ultimate 3000型二极管阵列检测器（美国DIONEX公司）；BT224S型万分之一天平（瑞士Sartoris公司）；Mettle AE24型十万分之一天平（瑞士Sartoris公司）；KQ-3200型超声清洗器（中国浙江昆山市超声仪器有限公司）；YF-111型二两装高速中药粉碎机（瑞安市永历制药机械有限公司）；SZ-93型自动双重纯水蒸馏器（上海雅荣生化仪器设备有限公司）。

补骨脂药材购自江西樟树药材市场（产地：河南），经江西中医药大学付晓梅副教授鉴定为豆科植物补骨脂Psoralea corylifoliaL.的干燥成熟果实。补骨脂素（10070-201302）、异补骨脂素（10521-201302）、异补骨脂查耳酮（493-201304）、补骨脂二氢黄酮（20494-201304）、Corylifol A（20495-201304）、新补骨脂异黄酮（20492-201304）及补骨脂酚（20491-201302）均购自江西南昌贝塔生物技术有限公司，纯度＞98%；乙腈（德国Merck公司）、甲酸均为色谱纯（美国Fisher公司）；陈年塔牌绍兴花雕酒（浙江塔牌绍兴酒有限公司，酒精度≥15.5%，酒龄1-3年）；精制深井盐（江西省盐业公司）。

2 实验方法与结果

2.1 不同炮制品的制备

2.2.1 酒浸炒

取净制补骨脂500 g，用1 500 mL黄酒浸泡一天，过滤，沥干，分次加入铁锅中（每次约50 g），用文火炒至微黄，膨胀，有香气，迸裂。取出，放凉，即得。

2.1.2 药典法

取净制补骨脂500 g，加入20%食盐溶液，闷润4 h，分次加入铁锅中（每次约100 g），用文火炒至微黄，膨胀，有香气，迸裂。取出，放凉，即得。（100 kg药材用2 kg食盐）。

2.1.3 蒸法

按照广州的方法，取补骨脂 500 g加盐水（盐l2 g -l00 mL）闷润过夜，蒸2 h。

2.1.4 清炒法

取净制补骨脂500 g，分次加入铁锅中（每次约100 g），用文火炒至微黄，膨胀，有香气，迸裂。取出，放凉，即得。

2.1.5 雷公法

取净制补骨脂500 g，先用1 500 mL黄酒浸泡1天，滤去黄酒，加入1 500 mL清水浸泡3天，过滤，沥干，置于锅中，隔水蒸6 h，取出，晒干，即得。

以上炮制品分别置搪瓷盘中，充分晾干，置干燥器备用。

2.2 色谱条件

Hypersil ODS2（4.6×250 mm，5 μm）色谱柱；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0-30 min，90%-50% A；30-45 min，50%-40% A；45-55 min，40%-30% A；55-60 min，30%-20% A，保持2 min，样品分析结束后平衡15 min；流量体积：1 mL·min-1；检测波长：246 nm；柱温：25 ℃；进样量：20 μL。实验结果见图1。

2.3 对照品储备液的配制

精密称取适量补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮、异补骨脂查耳酮、Corylifol A和补骨脂酚标准品，用甲醇配成浓度分别为3.008、2.848、1.556、0.780、1.772、1.286、15.00 mg·mL-1的溶液，上述储备液均置于棕色容量瓶中，并于4 ℃保存。

2.4 供试品溶液的制备

补骨脂药材粉碎过100目筛，精密称取0.1 g置10 mL容量瓶中，加9 mL甲醇超声提取30 min（室温），定容至10 mL，取部分溶液于离心机中，室温下12 000 rpm离心10 min，移取上层有机相2 mL，稀释至10 mL，取上清液20 μL注入HPLC色谱仪，记录相应化合物的峰面积。

2.5 线性关系和检出限考察

分别准确移取“2.3”项对照品储备液适量，置于同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀释，制得混合对照品溶液，其中补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮、异补骨脂查耳酮、Corylifol A和补骨脂酚的浓度分别为300.8、284.8、155.6、78、177.2、128.64、1 500 μg·mL-1，并逐级稀释成一系列不同浓度的对照品溶液，进样20 μL测定。以对照品浓度X（μg·mL-1）对峰面积Y进行线性回归；以信噪比3为检出限，实验结果见表1。结果表明，7个化合物在各自的浓度范围内线性关系良好。

2.6 精密度考察

取同一浓度的混合对照品溶液20 μL，按“2.2”项所述色谱条件连续进样6次测定，补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮、异补骨脂查耳酮、Corylifol A和补骨脂酚峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为 1.96%、1.99%、2.03%、2.02%、1.87%、2.35%和1.74%，表明精密度良好。

2.7 稳定性试验

图1 混合对照品（A）和供试品（B）

表1 补骨脂中7个化合物的回归方程、相关系数和检测限

取同一补骨脂炮制品供试品溶液，按“2.4”供试品溶液制备方法处理，分别于0、2、6、12、24、48 h进样20 μL测定，考察供试品溶液的稳定性。补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮、异补骨脂查耳酮、Corylifol A和补骨脂酚峰面积的RSD分别为2.72%、2.58%、2.49%、2.62%、2.44%、2.37%和2.03%。结果表明，供试品溶液室温放置48 h基本稳定。

2.8 重复性试验

取同一补骨脂炮制品粉末0.1 g，按“2.4”供试品溶液制备方法平行处理5份，按“2.2”项所述色谱条件分别进样测定，记录补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮、异补骨脂查耳酮、Corylifol A和补骨脂酚的峰面积，RSD分别为2.43%、2.29%、2.76%、2.87%、2.65%、2.58%和1.91%。

2.9 加样回收率试验

取蒸法补骨脂炮制品粉末0.05 g，共6份，分别准确加入与样品中含量相当的补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮、异补骨脂查耳酮、Corylifol A和补骨脂酚对照品储备液，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定，计算加样回收率（表2）。

2.10 样品含量测定

分别称取补骨脂生品及不同炮制品粉末约0.1 g，按“2.4”项方法制备供试品溶液，每批平行处理两份，按“2.2”项下色谱条件测定。计算样品中各成分的含量，实验结果见表3。所有的实验数据均以ˋx表示，采用SPSS17.0 统计软件绘制各化合物含量柱状图（图2）。

2.11 数据的统计分析

采用SPSS17.0 统计软件，对各炮制品的香豆素类化合物（补骨脂素和异补骨脂素含量的平均值）、黄酮类化合物（新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮、异补骨脂查耳酮、Corylifol A含量的平均值）及单萜酚化合物（补骨脂酚的含量）的含量进行主成分分析，综合主成分值分别为：生品-0.279 13、酒浸炒品1.619 66、药典法品（盐炙品）0.686 69、蒸法品-1.137 16、清炒品-0.18 235、雷公制品-0.70 771（表3）。由此可知，酒浸炒法和药典法对三类成分都为正影响，而其他炮制方法对三类成分的影响不一致。

表2 补骨脂中7个化合物的加样回收率（n=6）

图2 补骨脂不同炮制品中7个化合物的含量（±s，n=3）

2.12 实验结果

综合以上分析可知，补骨脂经不同方法炮制后各类成分含量均有变化：酒浸炒法、药典法、清炒法和雷公法炮制后香豆素类化合物的总含量极显著升高，顺序为酒浸炒法＞雷公法＞清炒法＞药典法＞生品，但蒸法使香豆素类化合物的总含量极显著降低；对于黄酮类化合物，酒浸炒法和药典法使其总含量显著升高，顺序为酒浸炒法＞药典法＞生品，而蒸法、清炒法和雷公法使其极显著降低，降低程度顺序为雷公法＞清炒法＞蒸法；而酚类化合物，酒浸法、药典法和清炒法使其含量显著升高，顺序为清炒法＞酒浸法＞药典法＞生品，但蒸法和雷公法使其显著性降低，且雷公法降低幅度大于蒸法。从以上分析可以得出以下结论：目前所采用的6种炮制方法中，综合三类化合物的含量来看，唯有药典法即盐炙法和酒浸炒法对三类化合物的含量均具升高作用，这与王增绘等[16]的研究结果有一点不同，该研究结果显示盐炙使补骨脂酚含量明显下降。

3 讨论

从古至今，补骨脂在临床被历代医家广泛用在治疗骨质疏松症的各类补肾健骨方中[3，4]。现代药理研究显示，补骨脂可通过调节骨转化，促进成骨细胞增殖活性、抑制破骨细胞的重吸收，从而对骨质疏松起到一定防治作用[5-8]。相关研究发现，ERα与ERβ受体在骨质疏松症的治疗中都参与了骨质的重建[10]。而补骨脂所含的化学成分能激动ERα与ERβ受体，按激动受体类型不同可分为两类：选择性激动ERα受体的和同时激动ERα和ERβ受体，但对ERβ的激动作用大于ERα的，第一类主要是香豆素类化合物，第二类包括黄酮类和酚类化合物[9]。本课题组前期研究显示，补骨脂酚在补骨脂中所占比例达4%左右，黄酮类成分占2%左右[17]，两者在治疗骨质疏松症中发挥的作用是不容忽视的。

表3 各位化合物含量值及主成分分析综合主成分值

本研究的实验结果显示，要使补骨脂在治疗骨质疏松症中发挥最大药效，即要求所采用的炮制方法能使香豆素类、黄酮类、单萜酚类化合物的含量升高。而煎煮溶剂的选择对化合物的煎出率影响较大。补骨脂汤剂（水煎煮）入药，会导致其水溶性小的黄酮及单萜酚类成分较难提取出来；而对于含补骨脂的中成药，其提取方法较多水提、醇提、粉末入药，或多种方法的综合运用。这就为炮制品的选择带来了一定难度。我们希望能在炮制品效应成分含量高低与提取方法的选择之间找到一个平衡点。综合以上信息，可以看出盐炙品、酒浸炒品在6种炮制品种占绝对优势。相对于盐炙品，酒浸炒品效果虽佳，但可操作性及经济性较盐炙品差。综上所述，本研究认为现行版中国药典选择以盐水炒有一定科学依据。

1 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典（一部）.北京：中国医药科技出版社,2015：187-188.

2 颜冬梅,高秀梅. 补骨脂化学成分的研究进展. 辽宁中医药大学学报,2012,14(9)：96-99.

3 Miura H, Nishida H, Linuma M. Effect of crude fractions ofPsoralea corylifoliaseed extract on bone calcification.Planta Med, 1996,62(2)：150-153.

4 邓平香,徐敏. 补骨脂对去卵巢大鼠骨转换及血脂代谢影响的实验研究. 新中医,2005,37(7)：94-96.

5 Xiong Z L, Guo X J, Meng F H. Osteoblastic proliferative activity of extracts of Qing'e pill and its disassembled formulae.Pharm Biol,2003,41(6)：434-438.

6 Wang D, Li F, Jiang Z. Osteoblastic proliferation stimulating activity of Psoralea corylifolia extracts and two of its flavonoids.Planta Med,2001,67(8)：748-749.

7 杨荣平,寿清耀,涂永勤,等. 补骨脂提取物对体外培养新生大鼠颅骨成骨细胞的影响. 中药新药与临床药理,2007,18(1)：32-34.

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11 宋·太医院. 圣济总录. 北京:人民卫生出版社,1962:3040.

12 南北朝·雷敩, 清·张骥(补辑), 施仲安(校注). 雷公炮炙论. 南京：江苏科学技术出版社,1985：56-57.

13 姚三桃,杨滨. 中药补骨脂炮制沿革的研究. 基层中药杂志,1996,10(1)：17-19.

14 杨滨,姚三桃,崔淑莲. 补骨脂古今主要炮制方法的比较. 中国中药杂志,1996,21(9)：537-539.

15 宋潇,戚爱棣,王跃飞,等. 不同炮制方法对补骨脂中4类化学成分的影响. 中国中药杂志,2011,36(15)：2071-2075.

16 王增绘,付娟,武拉斌,等. 基于UPLC-Q-TOF/MS技术的补骨脂盐炙前后化学成分变化研究. 中国实验方剂学杂志,2014,20(16)：51-55.

17 Yan Dongmei, Chang Yanxu, Kang Liyuan. Quality Evaluation and Regional Analysis of Psoraleae Fructus by HPLC-DAD-MS/MS plus Chemometrics.ChineseHerbalMedicines, 2010, 2(3)：216-223.

Effects of Different Processing Methods on the Antiosteoporotic Effective Compositions of Psoralea corylifolia L.

Li Na1, Yan Dongmei1, Zhang Jinlian1, Gao Xiumei2
(1. School of Pharmacy, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China; 2. The TCM Research Centre of Tianjin University of TCM, Tianjin 300193, China)

This study aimed at evaluating the effect of different processing methods on the contents of antiosteoporotic compositions inP. corylifolia. HPLC method adopted to analyze the contents of antiosteoporotic compositions， including coumarin (psoralen and isopsoralen)， flavonoids (neobavaisoflavone， corylifolin，corylifolinin and corylifol A) and meroterpenes (bakuchiol) inP. corylifolia. The contents were analyzed before and after the processing methods. Results： The results showed that the content of coumarin ， flavonoids and meroterpenes obviously changed in different processedP. Corylifoliain comparison with the crude drugs. In conclusion， it was demonstrated that the therapeutic efficacy of osteoporosis was enhanced by CP method which increased all of the three compositions. The testimony tallied with the Chinese medical theory： stir-frying with salt-water could enhance the effect of the tonification of spleen and kidney.

Psoralea corylifoliaL.， processing method， antiosteoporotic composition， effect

10.11842/wst.2017.01.019

R283.1

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：朱黎婷）

2015-12-08

修回日期：2016-12-16

＊ 国家自然科学基金委青年科学基金项目（81202911）：补骨脂炮制前后骨质疏松药效的变化及相关炮制机理研究，负责人：颜冬梅。

＊＊ 通讯作者：颜冬梅，讲师，主要研究方向：中药学教学及科研。