眼镜蛇神经毒素研究进展

蒋世强　潘能庆　鄢航

摘要 眼镜蛇毒神经毒素（Cobrotoxin，CT）是一种短链神经毒素，最早是从台湾眼镜蛇蛇毒中分离得到的。因其在镇痛和抗癌方面有着显著的效果而成为研究的热点，本文通过对近年来CT的结构、药理作用、镇痛、抗癌研究进展进行综述，旨在为各位研究者提供基础参考资料。

关键词 眼镜蛇；神经毒素；药理作用；体外表达

中图分类号 R282 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）04-0255-02

Abstract The cobra venom neurotoxin（Cobrotoxin，CT） is a kind of short chain neurotoxin that is isolated from the Taiwan cobra venom at the earliest.Because of its significant analgesic and anti-cancer effect，CT is becoming a hot research.This article summarized the research progress of structure，pharmacological effect，analgesic and anticancer of CT in recent years，aimed to provide basic references for researchers.

Key words cobrotoxin；pharmacological effect；in vitro expression

眼镜蛇神经毒素（Cobrotoxin，CT）不但在镇痛作用上具有持久、无耐受性、无成隐性和不良反应少等优点，同时具有抗癌作用。因此，其可开发成新型的镇痛药和抗癌药，应用前景广阔[1]。

1 眼镜蛇神经毒素的结构

1965年，Yang等通过CM-cellulose柱和Sephadex G-25柱从台湾眼镜蛇蛇毒中分离得到一种棒状晶体蛋白，将其命名为神经毒素，其毒性为粗毒的6.7倍，并具有热稳定性，但是通过胰蛋白酶消化后活性丧失[2]。CT的分子量约为7 KDa，由15种常见氨基酸组成，缺乏丙氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸，其空间结构为三指形，分子结构中一端为4个二硫键形成的致密内核，由内核向外伸出3对互为平行的肽链成三指形展开，分子中4个二硫键分别为Cys3-Cys24、Cys17-Cys41、Cys43-Cys54、Cys55-Cys60[3-6]。Yu等[7]研究发现CT的二硫键可以发生改变从而变成其同分异构体Cobrotoxin Ⅱ和Cobrotoxin Ⅲ，Cobrotoxin Ⅱ和Cobrotoxin Ⅲ二硫键分别变为Cys43-Cys55、Cys54-Cys60和Cys43-Cys60、Cys54-Cys55（图1）[8]。

2 眼镜蛇神经毒素的药理作用

眼镜蛇神经毒素属于短链突触后神经毒素，能以极强的亲和力与突触后膜上的烟酰胺型乙酰胆碱受体结合，阻止神经-肌肉通路的去极化，阻碍神经冲动传导[9]。若过量的CT将神经传导完全阻碍时，生物个体将会死亡，Meng等[10]从孟加拉眼镜蛇毒液中纯化得到的CT对小鼠的LD50仅为0.08 mg/g。关于CT的作用机制及其作用的位点一直是研究的热点，许多研究工作者已经做了不少探究工作。Chang等[11]对CT分子中的酪氨酸残基与其生物活性的关系进行了研究，发现Tyr-25残基的完整性在保持CT的活性构象中起着至关重要的作用。Yang等[12]研究发现，CT分子中精氨酸残基的修饰与CT的致死性和抗原性相关，Arg-30和Arg-33与CT的致死性有关，而Arg-30和Arg-36则与CT的抗原性有着密切关系。此外，还有类似的研究发现，完整的Trp-29、His-32、Lys-47、Glu-21都对CT活性构象的保持起着重要作用[13]。目前，尽管找到了不少可以改变CT活性构象的因素，但是还是没有确定CT的作用位点，因而其与乙酰胆碱如何结合的机制尚不清楚。Aoyagi等[14]通过人工合成与CT相似的肽链并进行相关试验，能够得到一些与CT相类似的反应，并且合成肽具有CT 20%的毒性活性。

3 眼镜蛇神经毒素的研究与应用

3.1 镇痛研究及应用

眼镜蛇神经毒素的镇痛研究历史悠久，自从1965年CT从台湾眼镜蛇中分离纯化之后，CT的镇痛研究就开始了，因其在镇痛方面具有高效性、无耐受性、无成隐性、不良反应少而被广泛研究。Chen等[15]的研究揭示了CT作用的机制。CT主要是通过作用于乙酰胆碱受体，从而阻碍神经传导达到镇痛的作用，对于CT镇痛过程中发挥作用的位点至今还不确定，这也是今后的研究重点与难点，更是CT能否得到应用的关键点。

蛇毒镇痛的应用早在我国20世纪70年代就出现了，曾才铭[16]用云南动物研究所用眼镜蛇毒提纯的神经毒素制成的针剂克痛灵用于临床治疗慢性腰腿痛，共治疗了100余例，取得一定的效果。同样的，蒲道学[17]将克痛灵用于治疗神经性头痛、三叉神经痛、坐骨神经痛共96例病人并且都取得了一定療效。这个名为“克痛灵”的蛇毒制剂的主要成分便为蛇毒神经毒素，CT便是其镇痛的主要成分之一。尽管我国蛇毒制剂的应用当时得到一定程度的推广，但是这个名为“克痛灵”的蛇毒制剂并没有得到更好的发展和升级，最后被市场淘汰，导致其淘汰的主要原因有4个：其一，当时蛋白分离技术的限制，导致得到的蛇毒制剂中含有其他成分，从而导致蛇毒制剂的效果不一致，有时还会有较大的副作用；其二，对蛇毒制剂的检测及监管不到位，导致蛇毒假制剂四处横行，最终导致这个行业的没落；其三，蛇毒分离成本过高，分离过程中回收率低，损失较多，因而无法产生更廉价的商品；其四，蛇毒的作用机制研究进展缓慢限制了蛇毒的应用。

3.2 抗癌研究

目前，CT在抗癌方面的研究報道还不像其镇痛报道那样多，不过在抗癌方面的研究并没有停止过，最近Shen等[18-19]报道了CT的抗癌作用，其研究结果显示，CT能够明显抑制A549细胞的体外生长，并且在CT作用过程中，通过激活P38-MARK信号通路上调细胞自噬的作用。此外，CT还能抑制A549细胞在裸鼠体内转移。尽管CT的抗癌研究还不够深入，但是从目前的研究报道来看，CT在抗癌的开发方面具有一定的潜力。人们期待在CT的抗癌效果、范围、机制方面进行更深入的研究，以便为CT的抗癌应用打下坚实的基础。

4 眼镜蛇神经毒素体外表达的研究

眼镜蛇神经毒素的克隆和表达始于20世纪90年代，主要得益于分子生物学的快速发展，越来越多的基因被克隆，以及克隆的效率越来越高。对于CT的克隆与表达的研究目的主要有2个，一是为了方便对CT本身的研究，例如对其序列进行分析，或是对CT序列进行定点突变，再进行表达，从而确定某个点对CT的活性、结构的影响，Chang等[20]对特定的氨基酸进行改变，研究了单个氨基酸替换对整个分子结构的影响；二是为了获得CT蛋白，以便应用于实践中。由于蛇毒资源有限、蛇毒分离成本高、蛇毒成分复杂药理作用不同，因而通过基因工程技术产生成分单一的蛇毒是破解这几个难题的重要途径，鄢航等[21-22]利用原核表达系统和真核系统对CT进行了表达，获得了该蛋白，并检测了其活性，结果发现，原核表达的CT活性不理想，而真核表达的CT具有较好的镇痛活性，然而其采用的是昆虫细胞表达，尽管表达蛋白的活性及产量都还不错，但是该方法的成本较高，并不适合规模化生产[23-27]。

5 展望

眼镜蛇神经毒素作为突触后神经毒素，有着非常好的镇痛效果及无成隐的优点，已经被研究了几十年，也取得了不错的成果，但是就目前情况来看，其镇痛的机制及体外表达还有待进一步研究。人们期待早日在这2个方面取得突破性的成果，为CT的广泛应用铺平道路。

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