腈水合酶制备关键技术研究

腈水合酶是一类可以催化腈类物质转化相应的酰胺类化合物的金属酶，工业上利用其催化丙烯腈转化为丙烯酰胺。该生物法制备丙烯酰胺工艺在1985年被开发，是生物法替代化学法的典型案例。

随着丙烯酰胺的需求不断扩大，国内外研究机构及学者对腈水合酶产生菌的分离选育、菌株特性研究、酶的形成条件、酶的结构和性质、生物合成机制、翻译后的成熟机制等进行了深入研究。如中国专利CN201710456875.6公开了一种改造腈水合酶及其应用，该发明改造腈水合酶的抗逆性、耐热性和产物耐受性都有显著提升，并且没有导致腈水合酶活性的降低。改造腈水合酶可催化获得高浓度丙烯酰胺产物，且可以多批次回用。CN201610035437.8为一种球化酶技术固定化腈水合酶的方法，该方法包括以下步骤：（1）向腈水合酶溶液中加入保护剂PLL，混合均匀作为水相；另向正己烷中加入表面活性剂span-80，混合均匀作为油相；再把水相和油相混合搅拌制成粗乳液；（2）将上步得到的粗乳液在5～30 kPa的跨膜压力下通过SPG膜乳化器，待粗乳液完全通过SPG膜后，即得到W/O型（油包水）乳液，然后向该乳液中滴加交联剂戊二醛，交联0.5～4 h，离心洗涤，即可得到球形腈水合酶粒子。该发明的制备工艺简单，条件温和，酶活回收率在50%以上。重复使用10次后，酶活还可达到初始酶活的45%左右。同游离酶相比，储藏稳定性也更好。CN201510244547.0公开了一种高效表达高分子量型腈水合酶的基因工程菌及其应用，该发明所述的高分子量型腈水合酶基因nhhB(rbs)A(rbs)G是基于R.rhodochrous J1来源的腈水合酶基因bag，经密码子优化及表达元件改造之后化学合成得到，该基因全长1 645 bp，编码533个氨基酸，能够在大肠杆菌中成功表达。该方法高效安全，在24℃诱导16 h即可获得96.7 U/mL可溶性腈水合酶，纯化后比酶活高达234 U/mg。该方法有利于生产过程中腈水合酶的提取纯化以及酰胺类物质的高效酶法合成。CN201510226690.7公开了一种比酶活和稳定性提高的融合型腈水合酶，其将来源于恶臭假单胞菌的腈水合酶在大肠杆菌中高效表达并采用亚基融合策略提高稳定性及产物耐受性。该发明方法简单高效安全，能够在较短的表达周期里获得稳定性高，产物耐受性强的大量可溶性腈水合酶，有利于在简单条件下进行大规模工业生产，以及进一步对融合型腈水合酶成熟机制的理论研究。CN201410843384.3公开了一种耐热重组腈水合酶基因、编码酶、载体、工程菌及其在催化腈化合物生成酰胺和生物降解除草剂敌草腈中的应用，该发明实现了源自慢生型大豆根瘤菌USDA 110中假定腈水合酶基因的功能表达，证明了一种腈水合酶的活化元件在表达过程中的关键作用。同时，该发明提供了一种在大肠杆菌内构建腈水合酶基因工程菌的方法，在腈水合酶基因在活化元件的参与下获得具有高表达量和高活性的腈水合酶。CN201410758150.9公开了一种腈水合酶及其应用，该腈水合酶由α亚基和β亚基组成。该发明从博得特氏菌DSM 12804(Bordetella petrii DSM 12804)中克隆到腈水合酶基因，该基因表达后成功获得具有高表达量和高活性而且底物谱广、具手性选择性的腈水合酶。CN201280028338.7提供催化活性提高了的改良型腈水合酶，并且提供编码该改良型腈水合酶的DNA、包含该DNA的重组载体、包含该重组载体的转化体、从该转化体的培养物中提取的腈水合酶及其制造方法。CN201110384089.2公开了一种克隆表达腈水合酶调控蛋白的方法，是采用在腈水合酶调控蛋白基因序列N端加His-tag，与腈水合酶成熟酶基因串联，在大肠杆菌BL21中共表达。

在现今微生物法生产丙烯酰胺的流程中，仍然普遍存在菌种的酶活稳定性差、对底物和产物的耐受性不高以及产物丙烯酰胺会向副产物丙烯酸进一步转化等问题。为此，利用基因工程手段研究腈水合酶在氨基酸序列、折叠方式和活性位点等方面的特性，并通过代谢工程优化水合反应的代谢过程，将成为今后微生物法生产丙烯酰胺的研究热点之一。

（江南大学图书馆 张群）