硒的检测方法研究进展

罗敏，陈德经，，*，代惠萍，江海，季晓辉

（1.陕西理工大学生物科学与工程学院，陕西汉中723001；2.陕西理工大学陕西省资源生物重点实验室，陕西汉中723001）

硒的检测方法研究进展

罗敏1，陈德经1，2，*，代惠萍2，江海2，季晓辉2

（1.陕西理工大学生物科学与工程学院，陕西汉中723001；2.陕西理工大学陕西省资源生物重点实验室，陕西汉中723001）

硒在自然界中以无机硒和有机硒两种形式存在。主要介绍硒形态的前处理方法以及荧光法、石墨炉原子吸收光谱法、氢化物原子荧光、液相色谱法、毛细管电泳法、比色法及各光谱法联用技术等不同检测方法、原理进行归纳，同时在导电性、酶活性、酶联免疫法方面有望成为有机硒的快速、准确、操作简便的检测方法，为硒的检测技术开发提供理论基础。

无机硒；有机硒；检测技术；研究进展

硒作为人体不可缺少的微量元素之一，其在自然界中存在形式为无机硒和有机硒，无机硒主要为亚硒酸盐与硒酸盐形式存在，以四价硒和六价硒为主要化学形态，具有剧毒[1]。有机硒的存在形式通常是硒代氨基酸、硒蛋白、硒多肽、硒多糖等形式[2]，使用比较安全，营养价值较高，可易在人体内所吸收利用。因此准确、高效的检测有机硒与无机硒有着重要的意义。近年来，硒的检测技术随着含硒样品种类的不同也越来越多，对于无机硒和有机硒的检测通常有石墨炉原子吸收法、氢化物发生原子荧光光谱法、火焰原子吸收光度法、分光光度法、荧光法、液相色谱法、气相色谱法、电感耦合等离子体发射光谱法、吸附极谱法、催化极谱法、阳极溶出伏安法、阴极溶出伏安法、氢化物发生原子吸收法以及联用技术等[3-4]。虽然检测方法很多，但每种测定方法都有其各自的优缺点。现将不同的检测方法的原理、方法及优缺点分别阐述。

1 硒形态的前处理方法

1.1 浸提法

提取剂一般有水浸提、酸浸提（HNO3-H2O2-HC1、Tris-HCl、）、碱浸提（KOH）、盐溶液浸提（2%NaCl）、醇浸提（70%CH3CH2OH）等，适用于无机硒和未结合到蛋白质中的有机硒小分子化合物，如硒酸盐、亚硒酸盐、甲基硒代半胱氨酸、γ-谷氨酸硒甲基硒代半胱氨酸等硒代氨基酸等水溶性的硒形态[5-8]。使用酸性试剂虽然可以提高提取效率，但是腐蚀性会对试样有影响，其中Tris-HCl有致癌作用；碱性试剂也可降解硒化合物[9]。

1.2 酶解法

提取剂一般有淀粉酶、蛋白酶K、蛋白酶XIV、纤维素酶、蛋白酶E、脂肪酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和链霉蛋白酶等，适用于以硒代氨基酸或者硒肽的形式结合在蛋白质中的硒形态[10-13]。在温和的环境下酶解法提取硒不仅具有较高效率，而且不破坏硒成分，在未来将成为提取硒形态的有效方法[9]。

2 无机硒的检测方法

2.1 荧光法

荧光法的原理是将样品在高氯酸与硝酸两者混合进行加热消化，使不同价态的硒转化成为无机硒，在酸性环境下，使试样中的Se6+还原成Se4+，再与2，3-二氨基萘（2，3-diaminonaphthalene，DAN）显色剂发生反应的同时生成4，5-苯并苤硒脑，最后的萃取剂为环己烷。反应激发波长是376nm，发射波长为520nm[14-15]。黄高凌等[16]用荧光法测定硒含量，检出限为0.22 μg/L、线性范围为 1 μg/L～30 μg/L、相对标准偏差 RSD＜ 2.9%，该法灵敏度高，方法简单迅速，但受萃取剂、温度、pH值的影响，操作繁琐费时，所用的试剂毒性大，检测的是总硒含量，不能有效的对有机硒和无机硒分辨。

梁爱惠等[17]对其传统的方法进行优化，在硫酸条件下，将四价硒与还原剂反应，将其还原为硒化氢，再用KI3吸收硒化氢，使罗丹明6G较少的结合I3-而使罗丹明6G荧光强度变大，荧光测定波长为562 nm。激发波长为480 nm。该方法的检出限为0.01 μg/mL，回收率在91.8%～107.1%之间。

2.2 石墨炉原子吸收光谱法

其原理是将样品前处理后直接注射到石墨炉中，形成的基态原子跃迁到较高能态所需能量的频率时，原子就产生共振吸收，再依据标准溶液测定硒含量，但在样品的消解过程中温度到400℃时会使硒蒸发，而损失一部分硒，测定不准确。因此使用基体改进技术来阻止硒的损失，它是往石墨炉或试样溶液中加入某种化学试剂，来增加待测样品溶液基体的挥发性，或提高待测易挥发元素的稳定性，提高灰化温度而消除或减小基体干扰，该方法灵敏度高，检出限低，但检出的是总硒含量，对有机硒的定量检测不准确[18-19]。

梅灿辉[20]提出使用胶体钯作为基体改进剂，样品不需要经过消解，只需要酸化与稀释后可直接上机测定，利用胶体钯-石墨炉原子吸收测定枸杞酒中硒含量，其检出限为26.74 pg，RSD值＜10%，加标回收率为102.60%，线性回归方程为Y=0.000 024x2+0.004 1x+0.017，相关系数 R2=0.998 8。刘娟丽等[21]提出使用Pd（NO3）2作为基体改进剂，利用石墨炉原子吸收光谱在196 nm测定饲料中的硒，检测限为0.33 μg/kg，回收率为95.0%～105.3%，硒含量在0～100 μg/kg成线性关系也取得较好的结果。

2.3 氢化物-原子荧光光谱法（hydride-generationatomic fluorescence spectrometry，HG-AFS）

在酸环境中将四价硒与还原剂硼氢化钾或硼氢化钠在氢化物系统中被还原成硒化氢，由氢气和硒化氢与载气氩气带入到原子化器，形成火焰，从而使硒元素被原子化，火焰中硒原子在空心硒阴极灯的照射下被激发，使基态硒被激发至高能态，再被活化回到基态时发射出荧光强度信号。在一定条件下产生的荧光强度与硒含量成正比[22-23]。

王世成等[24]使用三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）缓冲溶液提取法分离鸭蛋中的有机硒和无机硒，采用氢化物发生原子荧光光谱法检测，再利用差减法检测鸭蛋中无机硒和有机硒的含量，其无机硒的检出限为 0.003 mg/kg，测定线性范围为 2.0 μg/L～50 μg/L，相对标准偏差RSD为3.21%，加标回收率为82.8%～91.0%。

HG-AFS法光谱干扰少，谱线简单，灵敏度和准确度高，检出限低，适用于多种痕量元素的测定。采用差减法分析有机硒含量，这个是现行的标准GB 5009.93-2010《食品安全国家标准食品中硒的测定》[25]，但有机硒测定准确度差，对有机硒和无机硒的分离不准确。

2.4 电化学方法

电化学法主要包括催化极谱法、电位滴定法、阳极溶出伏安法、阴极溶出伏安法、离子选择电极法，其每种方法硒的检出限分别为（0.6、8、0.004、0.2、20μg/g）[26]。其硒的测定最常用的是催化极谱法与溶出伏安法，崔鹏[27]用催化极谱法测定硒的含量，检出限2.0 μg/L，相对标准偏差RSD为3.0%～1.6%，加标回收回收率104%～92%。该方法其灵敏度已达到或大于荧光法原子荧光法测定硒，准确度高、仪器简单、分析速度快和应用范围广但操作繁琐，适用范围窄。

2.5 比色法

在酸性环境下Se4+与3，3-二氨基联苯胺试剂显色反应生成黄色化合物，使用甲苯在pH约为7时萃取，样品需经过加入混酸加热消解使样品中硒的化合价消解为合适的价态即四价硒，再经盐酸反应使其六价硒最终还原为四价硒，再进行比色定量测定总硒含量。Na2-EDTA可消除样品中其它重金属离子，如：铜、铁等其干扰，此法据报道最低检出限为2.5 μg/L，测定上限为50 μg/L，灵敏度较低，检测限不能满足微量分析要求[28]。

3 有机硒的检测

3.1 高效液相色谱法

硒代甲硫氨酸、硒代蛋氨酸及其他氨基酸与4-氯-3，5-二硝基三氟甲苯柱前衍生，可产生的衍生物具有紫外吸收，再运用高效液相色谱仪分离，在240 nm处，进行紫外检测。此方法具有较高的精密度、低的检出限、检出成本低、操作简便，但目标物的出峰时间太晚，耽误检测效率，氨基酸干扰较大[29-30]。李红卫等[31]通过该法检测富硒米曲霉中有机硒形态，其硒代胱氨酸检出限（RSN=3）为0.680 mg/L，定量限（RSN=10）为2.244 mg/L，线性范围为 5.0 mg/L～100 mg/L，加标回收率为94.8%～105.8%。

3.2 气相色谱法

易挥发的硒化合物如二甲基硒、二甲基二硒适合使用气相色谱检测，难挥发的硒酸盐及硒代氨基酸需要被衍生成挥发性物质，再经萃取和色谱分离进行检测。张修景等[32]在用气相色谱法测定罗汉参中硒的含量时，将样品加入混酸微波消解，再经甲苯萃取和毛细管色谱柱分离，再经检测器进行硒的定性及定量分析，其最低检出限为0.003 mg/L，相对标准偏差（n=5）小于 1.1% ，在 0.005 μg/mL～0.025 μg/mL 硒含量范围内线性关系良好；加标回收率在98.0%～100.7%范围内。对于挥发性有机硒化合物的分析比较适用，具有较高的准确度、灵敏度高、精密度好、高选择性，但与试剂的选择密切相关。

3.3 高压液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱（high performance liquid chromatography-hydride generationatomic flurescence spectrometry，HPLC-HG-AFS）

目前矿物质元素化学形态检测的主要方法是联用技术，高效液相色谱与灵敏度较高的氢化物发生-原子荧光光谱联用应用于硒的各种形态分析，已成为一个很好的检测仪器。尚德荣等[33]利用HPLC-HG-AFS测定水产品中硒的赋存形态时对样品使用恒温超声提取，待测物使用PRP-X100阴离子交换柱，以pH值为6.0的磷酸盐缓冲液为流动相，利用高效液相色谱对试样中的硒代胱氨酸（SeCys）、硒代蛋氨酸（SeMet）、四价硒（SeIV）、六价硒（SeVI）分离后，使用氢化物原子荧光光谱进行检测，其检出限分别为1.2、0.8、1.4、2.1 ng/mL，RSD小于4.0%，线性相关系数均大于0.995，测试样品的平均回收率都在86.6%以上。该法灵敏度高，检出限低，光谱干扰小，但样品预处理繁琐，分析成本较高。但目前只能分析3种硒形态，亚硒酸盐、硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸[34-35]，因此，该技术可在优化选择适宜的浸提试剂，通过尝试震荡、超声、微波萃取等辅助浸提方法提取样品，得到不同基质的前处理方法上，建立快速、灵敏度高、准确性好、重现性好、分离度好的分离检测方法有待进一步研究。

3.4 高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法（high performance liquid chromatography inductively coupled plasma mass spectrometry，HPLC-ICP-MS）联用技术

HPLC的分离技术能达到高效分离的效果，特别适用于热稳定性较差、大的分子量、较强的极性物质的分离，和具有极低的检出限、干扰少、快速、精密度高等优点的ICP-MS联用，可准确分析微量元素同位素[36-37]。此技术不用试样的前处理，可直接测定各种氧化态硒[38]。吴雅颖等[39]将一定量的笋样品粉末置于用3 mL超纯水溶解20 mg链酶蛋白酶E后，37℃超声提取30 min，离心分离后，选用装有碰撞池的ICP-MS仪器色谱柱为Hamilton PRP X-100作为检测器，流动相为pH4.72柠檬酸溶液，流速为1.0 mL/min。采用超声波辅助酶提法提取雷竹笋硒形态，利用HPLC-ICP-MS联用技术分离测定有机硒，检出限在0.4 g/L～4.6 g/L，6种硒形态的加标回收率在80%～117%。

该方法有较强的分离能力、高效、精准、分析速度快等优点，主要用于形态分析，适合于食品中硒酸盐（Se VI）、亚硒酸盐（Se IV）、硒代蛋氨酸（Se Met）、硒代胱氨酸（Se Cys2）、甲基硒代半胱氨酸（Me Se Cys）和硒代乙硫氨酸（Se Et）的定性定量分析，但仪器价格太高，在实际应用中被限制[40]。

3.5 毛细管电泳—电感耦合等离子体质谱

毛细管电泳可分离不同样品的形态，是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术，毛细管电泳法中电泳的重现性不高，影响定性定量结果，因此使用联用技术组成具有高灵敏度与选择性的分离方法。郑进平使用毛细管电泳—电感耦合等离子体质谱（capillary electrophoresis-inductively coupled plasma mass spectrometry，CE-ICP-MS）联用分析方法，方法检测限达到0.2ngSe/mL～0.9ngSe/mL，RSD（n=6）为 3%～5%，加标回收率为80%～102%[41]。

4 其它方法

随着科学技术的发展与进步，在提取，样品的处理及分析方法也随之变化，而出现的一些新方法在准确度，灵敏性，选择性上也各有特色。如：超高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶中游离硒代蛋氨酸，其Se Met线性范围为0.5 ng/mL～100 ng/mL，方法的定量下限为0.5 ng/mL。定量下限准确度87.14%，RSD为3.95%，超高效液相色谱-串联质谱法（ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法具有重复性好、特异性好、分析时间短、灵敏度高、操作简单的优点。但所需仪器设备仪器昂贵，普及度不高，使用受到限制[42]。浊点萃取-共振瑞利散射法，其原理是萃取硒与吡咯啶二硫代氨基甲酸铵（pyrrolidine dithio charboxylic acid ammer，PDCA）生成稳定的螯合物表面活性剂相，并利用表面活性剂相在470 nm有最大吸收峰来检测硒含量，王梅利用该法测定富硒螺旋藻片中的硒检出限为0.006 3 μg/mL，RSD为2.65%，加标回收率为105.8%，该法检出限低，干扰小，但只能检测四价硒[43]。

5 展望

采用差减法分析有机硒含量，这个是现行的标准，但对有机硒测定准确度差，对有机硒和无机硒的分离不准确。同时样品处理过程中需要大量的强酸消解（体积比1∶1盐酸；体积比4∶1混合酸等），过程繁琐。所使用的测定仪器要求门槛较高，而在未来有机硒的快速检测中依据硒在光照下的导电性差异[44-45]，探讨光照与硒的含量和导电性的关系，优化条件，定性定量分析有机硒。其次依据有机硒可使GSH-Px酶活性提高[46-48]，探讨酶促反应条件下的生化检测技术定性定量鉴别无机硒和有机硒。再次采用生物免疫学方法检测有机硒的含量，如制备硒蛋氨酸单克隆抗体，并采用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[49-51]直接区分有机硒与无机硒，有望成为分析有机硒和无机硒的新型技术，并能够满足再现性好、精确度高、检出限较高、方法操作简便，检验检测成本低，能够定量准确检测出硒氨基酸、硒蛋白、硒核酸以及硒多糖等多种化合物结合形式的有机硒含量，且实用性广泛的快速检测方法。

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Research Progress of Detection Methods of Selenium

LUO Min1，CHEN De-jing1，2，*，DAI HUI-ping2，JIANG Hai2，JI XIAO-hui2
（1.College of Biological Science and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723001，Shaanxi，China；2.Bio-resource Key Laboratory of Shaanxi Province，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723001，Shaanxi，China）

Selenium exists in nature in two forms：inorganic selenium and organic selenium.Mainly introduces the pretreatment method of selenium form and the different detection methods，such as fluorescence method,graphite furnace atomic absorption spectrometry，hydride atomic fluorescence,liquid chromatography，capillary electrophoresis，colorimetric method and spectroscopy.It is expected to be a rapid,accurate and easy method for the determination of organic selenium in the aspects of conductivity，enzyme activity and enzyme-linked immunoassay，and provided a theoretical basis for the development of selenium detection technology.

inorganic selenium；organic selenium；detection methods；research progress

2016-12-24

陕西省农业攻关项目（2015NY012）

罗敏（1990—），女（汉），在读硕士研究生，研究方向：食品生物化学。

*通信作者：陈德经（1961—），男（汉），教授，硕士生导师，研究方向：食品生物技术。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.041