碳青霉烯类耐药阴沟肠杆菌耐药机制及同源性分析

谢逢春++++胡龙华++++宁长秀++++金迎庆

[摘要]目的 探讨碳青霉烯类耐药阴沟肠杆菌耐药机制及同源性。方法 选取2014年10月～2016年3月南昌仁爱妇产医院、南昌大学第二附属医院、抚州市第一人民医院检验科分离出的60株耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌作为研究对象，采用药敏实验分析耐药率、改良Hodge试验及乙二胺四乙酸（EDTA）协同试验检测碳青霉烯酶、聚合酶链反应（PCR）扩增耐药基因并确定基因型、脉冲场凝胶电泳（PFGE）分析菌株同源性。结果 60株菌株对抗菌药物的耐药率前3位依次为：头孢西丁（100.0%）、头孢他啶（90.0%）、氨曲南（90.0%），多黏菌素B耐药率最低（5.0%）；改良Hodge试验阳性率为76.7%，EDTA协同试验阳性率为81.7%；60株菌株中檢出碳青霉烯酶基因39株，其中KPC-2 3株，IMP-4 24株，IMP-8 12株，携带其他β-内酰胺酶基因45株；60株菌株经PFGE分为A-O 20种不同的型别59株，仅有1株多次分型均未成功。结论 阴沟肠杆菌耐药机制主要与KPC、IMP基因有关。

[关键词]碳青霉烯酶；阴沟肠杆菌；耐药机制；同源性

[中图分类号] R379.9 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）02（c）-0126-03

Resistance mechanism and homology of Enterobacter cloacae resistant to carbapenem

XIE Feng-chun1 HU Long-hua2▲ NING Chang-xiu3 JIN Ying-qing1

1.Department of Clinical Laboratory，Nanchang Charity Hospital for Gynecology and Obstetrics，Nanchang 330025，China；2.Department of Clinical Laboratory，the Second Hospital Affiliated to Nanchang University，Nanchang 330025，China；3.Department of Clinical Laboratory，the First People′s Hospital of Fuzhou City in Jiangxi Province，Fuzhou 344000，China

[Abstract]Objective To explore the resistance mechanism and homology of Enterobacter cloacae resistant to carbapenem.Methods 60 separated strains of Enterobacter cloacae resistant to carbapenem from October 2014 to March 2016 of Clinical Laboratory from Nanchang Charity Hospital for Gynecology and Obstetrics，the Second Hospital Affiliated to Nanchang University and the First People′s Hospital of Fuzhou City were selected as study objects.Drug sensitivity test was used to analyze the resistance rate，modified Hodge test and EDTA synergy test were used to detected carbapenem， PCR was used to amplify resistance genes and determinate genotypes，PFGE was used to analyze Strain homology.Results The resistance rate of 60 strains to antibiotics in the top 3 were Cefoxitin （100.0%），Ceftazidime （90.0%），Atreonam （90.0%） and Polymyxin B was the lowest （5.0%）.The positive rate of modified Hodge test and EDTA synergy test were respectively 76.7% and 81.7%，and 39 strains of carbapenem gene were detected in the 60 strains，and 3 strains with KPC-2，24 strains with IMP-4，12 strains with IMP-8，45 strains with other β-lactamase gene；60 strains were divided into A-O by PFGE， 20 different types of 59 strains and only 1 strain was not successful in type.Conclusion The resistance mechanism of Enterobacter cloacae are mainly with KPC and IMP gene.

[Key words]Carbapenem；Enterobacter cloacae；Resistance mechanism；Homology阴沟肠杆菌广泛存在于土壤、水等外界环境和肠道中，是肠道正常菌种之一，亦是临床上常见的感染病原体。临床研究表明，其可导致皮肤和软组织、下呼吸道、尿路、伤口及中枢神经系统感染[1]。由于阴沟肠杆菌对多种抗菌药物耐药，因而临床治疗难度较大。其耐药机制主要为可产生超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）和高产头孢菌素酶（AmpC酶）[2]。碳青霉烯类抗生素对产AmpC和ESBL的革兰阴性杆菌具有很好的治疗效果，是治疗多重耐药肠杆菌感染的最后选择[3-4]。近年来，随着碳青霉烯类抗生素的大量甚至过度使用，开始出现新型耐药菌，碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌逐渐增加，给临床抗感染治疗带来严重挑战。本研究探讨碳青霉烯类耐药阴沟肠杆菌的耐药机制，旨在为阴沟肠杆菌感染的临床治疗提供参考。现报道如下。

1材料与方法

1.1 材料

收集2014年10月～2016年3月南昌仁爱妇产医院、南昌大学第二附属医院、抚州市第一人民医院检验科分离出的60株耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌，剔除同一患者重复送检相同标本及同一部位的重复菌株。全部菌株中分离于痰液8例，尿液6例，血液标本5例，胸腔积液2例， 脓液25例，导管液14例。采用法国梅里埃生物公司生产的VITEK-2型全自动微生物分析鉴定菌株。质控菌株采用大肠埃希菌ATCC25922。

1.2方法

1.2.1药敏实验 药敏纸片包括头孢噻肟、头孢吡肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢西丁、頭孢唑林、呋喃妥因、环丙沙星、庆大霉素、美洛培南、氨曲南、复方新诺明、左氧氟沙星、多黏菌素B、亚胺培南，由英国Oxoid公司提供；厄他培南（ETP）、亚胺培南（MP）E-test条由瑞典AB BIODISK公司提供。采用琼脂稀释法进行药敏试验，测定抗菌药物对菌株的MIC。参照美国临床实验室标准化协会（CLSI） 2012版[5]判定结果。

1.2.2改良Hodge试验 采用直接菌落悬液法制备0.5麦氏浊度单位的大肠埃希菌ATCC25922菌液，以氯化钠溶液稀释10倍后在MH琼脂平板上涂抹均匀，晾干后将美罗培南纸片（10 μg/片）贴于中部，以接种环挑取待测菌菌落，于平板边缘向外划直线，37℃下培养过夜。MHT阳性：美罗培南抑菌圈处出现向内生长，表明该菌株产碳青霉烯酶[6-7]。

1.2.3 EDTA协同试验 采用K-B法将新鲜待测菌0.5麦氏浊度均匀涂布于MH琼脂平板，亚胺培南纸片（30 μg/片）贴于中间，同时在纸旁张贴1张无菌白纸，两纸片边缘间距需为12～15 mm，将10 μl 0.5 mol/L 的EDTA 溶液滴于白纸上，37℃下培养过夜。协同试验阳性：含EDTA白纸方向亚胺培南抑菌圈扩大，表明该菌株产ESBLs[8-9]。

1.2.4耐药基因PCR检测 制备检测基因模板。以实验菌株、受体菌株DNA、接合菌株中提取的质粒、标准菌株大肠埃希菌DNA为模板进行PCR反应。碳青霉烯酶基因的检测采用PCR扩增法，具体条件如下。模板：2 μl，体系：F 1 μl、R 1 μl，ddH2O 9 μl，dNTPs 11.5 μl，Tag酶0.5 μl；循环参数设定如下：94℃预变性5 min，94℃ 45 s，52℃ 45 s，72℃ 45 s，循环30次后72℃延伸10 min。提纯获取的基因阳性菌株PCR扩增产物，双向测序下与已知序列对比，确定基因型。

1.2.5菌株同源性分析 菌株同源性检测采用脉冲场凝胶电泳（PFGE），以Bionumerics软件分析对PFGE电泳图谱条带的相似系数进行分析，相似比85%及以上为同一菌株的不同克隆亚型[10-11]。

2 结果

2.1药敏试验结果

60株耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌对抗菌药物的耐药率前3位依次为：头孢西丁（100.0%）、头孢他啶（90.0%）、氨曲南（90.0%），多黏菌素B耐药率最低（5.0%）（表1）。

2.2改良Hodge试验及EDTA协同试验结果

60株耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌中改良Hodge试验阳性46例，阳性率为76.7%；EDTA协同试验发现49株（81.7%）产ESBLs。

2.3 耐药基因检测结果

60株耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌中检出碳青霉烯酶基因39株，其中KPC-2 3株，IMP-4 24株，IMP-8 12株，携带其他β-内酰胺酶基因45株。

2.4同源性分析

60株耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌经PFGE分为A-O 20种不同的型别59株，仅有1株多次分型均未成功。

3 讨论

近年来，随着广谱抗生素的普遍应用，细菌耐药引起全球医学界的关注。阴沟肠杆菌是社区及医院感染的引起感染的革兰阴性杆菌，可导致多部位及多器官感染。目前临床上出现越来越多的碳青霉烯类耐药阴沟肠杆菌，诱发难治性感染，因此，研究碳青霉烯类耐药阴沟肠杆菌的耐药机制以为阴沟肠杆菌感染的临床治疗提供参考具有重要意义。

本研究得到大多数阴沟肠杆菌属于多重耐药菌，且对抗生素的耐药水平很高。全部菌株对抗菌药物的耐药率前3位依次为：头孢西丁（100.0%）、头孢他啶（90.0%）、氨曲南（90.0%），提示上述三种抗生素对阴沟肠杆菌几乎无作用，其原因可能与过度使用有关，提示临床上应酌情使用头孢西丁、头孢他啶及氨曲南。另外，60株阴沟肠杆菌对多黏菌素B耐药率仅为5.0%，表明其对治疗阴沟肠杆菌有效，但多黏菌素B具有高毒性，因而临床应用受限。与此同时，本研究结果显示，阴沟肠杆菌对亚胺培南的耐药率（56.7%）高于美罗培南（36.7%），原因为亚胺培南的抗菌作用靶位为PBP2，而美罗培南的抗菌作用靶位包括PBP3和PBP2[12]。改良Hodge试验阳性率为76.7%，出现假阳性的作用机制为细菌外膜蛋白、AmpC酶缺失或菌株携带且高表达ESBL[13]。受试阴沟肠杆菌中检测出KPC、IMP基因，提示阴沟肠杆菌耐药机制主要与KPC、IMP基因有关，与既往研究[14-15]一致。KPC酶属于Ambler分类的A类丝氨酸β内酰胺酶，可在多数肠杆菌科细菌中被发现。其与SME碳青霉烯酶有45%的氨基酸同源性，可通过质粒介导产生耐药。IMP酶多与aac、qnrS、AmpC、ESBLs及膜孔蛋白缺失共同作用导致耐药。沟肠杆菌中主要的IMP酶包括IMP-8、IMP-4、IMP-1。耐药基因同源性分析得到60株菌株经被分为 20种不同的型别，提示上述菌株来源于不同个体，敏感性细菌可能接受耐药菌株水平传播的耐药基因。

综上所述，碳青霉烯类耐药阴沟肠杆菌耐药机制复杂，主要与KPC、IMP基因有关，院内感染应多关注该类菌株的传播。为避免阴沟肠杆菌的播散和耐药谱的扩大，应建立检测体系，为阴沟肠杆菌的预防和控制提供参考依据。

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（收稿日期：2016-11-14 本文编辑：许俊琴）