明日叶不同极性溶剂萃取物的活性研究

朱 芳韦万丽 杜 莹 陈 婷 周清娣 廖莉玲

(1. 贵州师范大学化学与材料科学学院，贵州 贵阳 550001；2. 悉尼大学化学学院，澳大利亚 悉尼 2006)

明日叶不同极性溶剂萃取物的活性研究

朱 芳1韦万丽1杜 莹1陈 婷1周清娣2廖莉玲1

(1. 贵州师范大学化学与材料科学学院，贵州 贵阳 550001；2. 悉尼大学化学学院，澳大利亚 悉尼 2006)

为比较明日叶不同极性部位的活性，将明日叶粗提取物过HPD-600大孔树脂，收集50%乙醇洗脱物。采用不同极性有机溶剂对50%洗脱物进行液—液萃取，将50%洗脱物分为乙酸乙酯相、正丁醇相、水相三个不同极性溶剂萃取物，测定不同极性溶剂萃取物的总黄酮和总多酚含量，研究各萃取物清除DPPH自由基、ABTS自由基能力和总还原能力以及对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。结果表明：乙酸乙酯相的总黄酮含量以及总多酚含量高于其他溶剂相，且体外抗氧化能力和对α-葡萄糖苷酶的抑制活性最强。明日叶不同极性溶剂萃取物的抗氧化活性和对α-葡萄糖苷酶的抑制率随着浓度的增加而增加。

明日叶；抗氧化；α-葡萄糖苷酶；抑制活性

明日叶是一种芹科多年生草本植物，药食兼用。原产于日本，因富含多种天然活性物质，被誉为“21世纪的健康食品”[1]。研究[2-4]表明明日叶富含的黄酮类物质具有抗癌、降血糖、抗衰老等功效。目前，已经有不少文献[5-6]对明日叶总黄酮的提取和纯化进行了报道，但鲜有文献对明日叶的活性部位进行追踪，而本研究拟采用简便快捷的方法，先将明日叶粗提取物过HPD-600树脂，再将大孔树脂纯化后的样品分为乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水相部位，采用清除DPPH、ABTS自由基，总还原能力和对α-葡萄糖苷酶活性抑制的方法来评价明目叶不同极性溶剂萃取物的抗氧化活性及对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，旨在追踪明日叶的活性部位，为明日叶活性物质的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

明日叶：上海交通大学农业与生物学院种植实验基地；

芦丁标准品：分析纯，贵州迪大科技有限责任公司；

二苯基苦味酰基苯肼：分析纯，东京化成株式会社；

α-葡糖糖苷酶：100 U/mg，Sigma-Aldrich Company；

4-硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷：分析纯，Sigma-Aldrich Company;

没食子酸标准品：分析纯，天津市科密欧化学试剂开发中心；

其余试剂均为分析纯；

HPD-600树脂：沧州宝恩吸附材料科技有限公司；

分光光度计：L5s型，上海仪电分析仪器有限公司；

旋转蒸发仪：RE-52型，上海亚荣生化仪器厂；

电子天平：A200S型，德国sartorius公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品的制备 将晾干的明日叶粉碎过40目筛，称取60 g明日叶粉末与53%的乙醇按1∶17(g/mL)的料液比混匀，在82 ℃水浴提取两次，每次2 h，合并两次提取液，抽滤，50 ℃真空减压浓缩至粉末状得到粗品。取一定量的蒸馏水溶解粗品，配成总黄酮含量为2～3 mg/mL的溶液，以2 BV/h 的流速过HPD-600树脂至树脂吸附饱和后，用50%的乙醇溶液进行洗脱，直至洗脱液无色。收集洗脱液旋干得到大孔树脂纯化的样品，将大孔树脂未吸附的部分旋干得到过柱液样品。将大孔树脂纯化后的样品，加适量的蒸馏水溶解，充分混匀后转移到分液漏斗中。依次用乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，旋干各相溶液分别得到乙酸乙酯相、正丁醇相、水相样品，并按式(1)计算得率：

(1)

式中：

C——得率，%；

m1——旋干后各部分样品质量，g；

m2——起始加入的明日叶粉末质量，g。

1.2.2 总黄酮含量的测定 采用NaNO2—Al(NO3)3比色法[7]。以芦丁为标准品，在200～700 nm波长范围扫描，确定其最大吸收波长为515 nm。在515 nm处测定标准系列的吸光度，并以吸光度(Y)对黄酮浓度(X)作图，得回归方程为：Y=11.466X-0.001 4，R2=0.999 9。按同样方法测定不同溶剂萃取物样品的吸光度，代入标准曲线方程，计算各溶剂萃取物样品的总黄酮含量。

1.2.3 总多酚含量的测定 参考文献[8]。以没食子酸为标准品，在最大吸收波长769 nm下测定标准系列的吸光度。以吸光度(Y)对多酚浓度(X)作图，得回归方程Y=132.3X-0.001 7，R2=0.999 9。在同种方法下测定不同样品的吸光度，代入标准曲线方程，计算各溶剂萃取物样品的总多酚含量。

1.2.4 抗氧化能力测定

(1) 清除DPPH自由基能力的测定：根据文献[9]，修改如下：取一定质量的样品，用30%的乙醇溶液溶解配成不同浓度的样液。分别向比色管中加入1 mL样液，再加入0.1 mg/mL的DPPH溶液1.6 mL，最后用无水乙醇定容至6 mL。摇匀避光保存30 min后，在517 nm波长处测定吸光度，每个样品平行测定3次。按式(2)计算清除率：

(2)

式中：

R0——自由基清除率，%；

A1——待测体系的吸光度；

A2——不加自由基体系的吸光度；

A3——不加样液体系的吸光度。

(2) 清除ABTS自由基的测定：根据文献[10]，修改如下：取7 mmol/L的ABTS溶液50 mL与2.45 mmol/L的过硫酸钾溶液50 mL混合均匀后，置于暗处反应12～16 h，制备ABTS+·溶液。使用前用蒸馏水按1∶40(体积比)进行稀释，使得ABTS+·溶液吸光度在734 nm处为0.698。取0.2 mL样液与4 mL ABTS+·溶液混匀，室温下反应10 min后。测其吸光度，平行测定3次，清除率按式(2)计算。

(3) 总还原能力测定：根据文献[11]修改如下：取0.5 mL 样液，加入1 mL PBS(0.2 mol/L，pH=6.8)溶液， 1%六氰合铁酸钾溶液1 mL混匀，于50 ℃水浴20 min后，快速冷却至室温。加入10%三氯乙酸溶液1 mL，混匀后离心10 min，取2.5 mL上清液，加2.5 mL蒸馏水和0.1%氯化铁溶液0.5 mL，静置10 min后，在700 nm处测其吸光度记为Ai，用蒸馏水代替样液测得A0。每个样品平行测定3次。

1.2.5 对α-葡萄糖苷酶活性的抑制 根据文献[12]修改如下：分别向离心管中加入样液0.2 mL， 0.5 U/mL的α-葡萄糖苷酶0.2 mL，于37 ℃的恒温水浴锅中反应10 min后，加入5 mmol/L的PNPG 0.1 mL，在37 ℃条件下继续反应15 min后，加入0.2 moL/L的Na2CO31.4 mL终止反应，用0.1 moL/L pH=6.8的缓冲溶液定容至10 mL。在402 nm处测定其吸光度，平行3次，按式(3)计算抑制率。

(3)

式中：

R1——对α-葡萄糖苷酶的抑制率，%；

A空——不加样液体系的吸光度；

A样——待测体系吸光度；

A背景——不加酶体系的吸光度。

2 结果与分析

2.1 明日叶不同极性溶剂萃取物总黄酮和总多酚的含量

由表1可知，不同部分的样品得率相差较大，粗品得率为23.42%，经大孔树脂纯化后的样品得率为2.35%，而不被吸附的过柱液部分得率较高。纯化后的样品经不同极性的溶剂萃取后，各相萃取物得率相差不大，其中水相的得率最高。说明大孔树脂纯化部分样品中水溶性物质较多。

粗品经大孔树脂HPD-600纯化后，总黄酮含量提升近6.3倍，总多酚含量提升近5.8倍。而过柱液中总黄酮和总多酚含量较低，说明HPD-600树脂对明日叶中的黄酮可以很好地富集。纯化后的样品经不同极性溶剂萃取分段后，各段的总黄酮和总多酚含量相差较大，乙酸乙酯部分总黄酮和总多酚含量最高，说明明日叶中的黄酮类物质属于中等极性。

2.2 明日叶不同极性溶剂萃取物的抗氧化活性

不同极性溶剂萃取物清除DPPH·效果见图1、表2。由图1可知，不同极性溶剂萃取物对DPPH·的清除能力随着浓度的增加而增强，最终趋向平稳；但不同萃取物在相同浓度下，清除率相差较大。由表2可知，清除DPPH·的能力大小依次是VC>乙酸乙酯相>大孔树脂纯化品>正丁醇相>水相>粗品>过柱液。

不同溶剂萃取物清除ABTS+·的效果见图2、表2。由图2可知，不同极性溶剂萃取物对ABTS+·的清除率随浓度的增大而增大，且对ABTS+·的清除能力相差较大。由表2可知，清除能力依次是VC>乙酸乙酯相>大孔树脂纯化品>正丁醇相>水相>粗品>过柱液。

由图3可知，不同极性萃取物的还原能力随浓度的增大而增强，还原能力依次是VC>乙酸乙酯相>大孔树脂纯化品>正丁醇相>水相>粗品>过柱液。

Figure 3 Ferric-reducing antioxidant power of different polar solvents of extracts fromAngelicaKeiskei

综上所述，明日叶不同极性溶剂萃取物清除DPPH·、ABTS+·及总还原能力顺序均为VC>乙酸乙酯相>大孔树脂纯化品>正丁醇相>水相>粗品>过柱液，表明不同极性部位样品的抗氧化能力大小顺序是VC>乙酸乙酯相>大孔树脂纯化品>正丁醇相>水相>粗品>过柱液。而各样品的总黄酮、总多酚的含量顺序与其抗氧化能力顺序一致，即存在正相关性，说明黄酮、多酚是明日叶主要的抗氧化物质。而乙酸乙酯相的黄酮、多酚含量最高，因此乙酸乙酯抗氧化活性最强，活性物质也较多。

2.3 明日叶不同极性溶剂萃取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性

α-葡萄糖苷酶在人体糖类的代谢过程中发挥重要作用，α-葡萄糖苷酶抑制剂可以降低酶的活性，减缓碳水化合物的分解，使得血糖降低[13]。体外降血糖活性多采用以PNPG为底物的酶抑制剂筛选模型来衡量物质对α-葡萄糖苷酶的抑制活性[14]。各样品对α-葡萄糖苷酶的抑制效果见图4、表2。由图4可知，抑制率随着样品浓度的增加而增加。由表2可知，抑制率依次是阿卡波糖>乙酸乙酯相>水相>大孔树脂纯化品>正丁醇相>粗品>过柱液。可以看出明日叶乙酸乙酯对α-葡萄糖苷酶有很好的抑制作用，在0.5 mg/mL时，其抑制率能达85%，与阿卡波糖的抑制作用相差不大。因此，对α-葡萄糖苷酶抑制活性最强部位为乙酸乙酯部位，由于乙酸乙酯总黄酮含量高达73%，总多酚含量达27%，推测其活性物质可能为黄酮、多酚物质。可以从乙酸乙酯相进一步分离其活性物质，此外，水相部位黄酮、多酚含量低于大孔树脂后样品，但其α-葡萄糖苷酶抑制活性却高于大孔树脂纯化后的样品，说明水相中存在非黄酮、多酚的活性物质，有待进一步深入研究。

3 结论

明日叶不同极性溶剂萃取物均有较强的还原能力并能有效地清除DPPH、ABTS自由基，具有良好的抗氧化活性，抗氧化活性最强的是黄酮、多酚含量最高的乙酸乙酯相，其他萃取物的抗氧化活性强弱顺序均与总黄酮、总多酚的含量大小顺序一致，即抗氧化活性与总黄酮、总多酚含量呈正相关关系，说明明日叶中总黄酮、总多酚是主要的抗氧化成分之一。在对α-葡萄糖苷酶的抑制活性测定中，发现，不同极性萃取物均有一定的抑制活性，其中总黄酮含量最高的乙酸乙酯相萃取物活性最高，与阿卡波糖的抑制效果相当，其次，水相萃取物的抑制活性也较强，但黄酮含量不高，说明在水相萃取物中可能含有其他的活性物质，有待进一步研究。通过对明日叶不同极性萃取物的抗氧化活性和对α-葡萄糖苷酶的抑制活性测定证实明日叶中的活性最强的部位在乙酸乙酯相，可通过进一步的分离纯化得到有效成分，为明日叶产品的开发利用提供理论依据。

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The studies onactivities of extracts fromAngelicaKeiskeiusing different polar solvents

ZHU Fang1WEIWan-li1DUYing1CHENTing1ZHOUQing-di2LIAOLi-ling1

(1.SchoolofChemistryandMaterialsScience,GuizhouNormalUniversity,Guiyang,Guizhou55000,China2.SchoolofChemistry,theUniversityofSydney,Sydney2006,Australia)

In order to compare the activities of different extracts using several polar fractions of extracts fromAngelicaKeiskei, the crude extracts were adsorbed by HPD-600 macroporous resin, and 50% ethanol eluents were collected as products. The products were separated into three different polar solvents for extracting, i.e., ethyl acetate fraction, n-butanol fraction and aqueous fraction, and extracted by organic solvents of different polarities based on liquids-liquids extracting method. Moreover, the contents of total phenolic and flavonoid in different extracts were determined, and then the activities on scavenging DPPH, ABTS radical, ferric-reducing power and inhibiting toα-glucosidase were also studied. The results showed that the ethyl acetate-soluble fraction had high contents of total phenolic and flavonoid with the strongest antioxidant andα-glucosidase inhibitory activities. The antioxidant activity and inhibitory rate ofα-glucosidase of the extracts fromA.Keiskeiincreased according with the their concentration increasing.

AngelicaKeiskei; antioxidant ability;α-glucosidase; inhibitory activity

贵州省科学技术厅中药现代化攻关项目(编号：黔科合ZY字【2012】3012号)；贵阳市科技局现代药业计划项目(编号：筑科合同[2012204]号)；教育部春晖计划(编号：Z2016012)

朱芳，女，贵州师范大学在读硕士研究生。

廖莉玲(1963—)，女，贵州师范大学教授，硕士。 E-mail:lll6383@163.com

2016-12-11

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.033