斑马鱼胚胎及成年斑马鱼端脑中神经胶质成熟因子β的表达观察

杜明君，殷果(南方医科大学南方医院，广州 510515)

斑马鱼胚胎及成年斑马鱼端脑中神经胶质成熟因子β的表达观察

杜明君，殷果
(南方医科大学南方医院，广州 510515)

目的 观察斑马鱼胚胎及成年斑马鱼端脑中神经胶质成熟因子β(GMFβ)的表达变化。方法 采用整胚原位杂交技术检测斑马鱼胚胎中的GMFβ mRNA；采用Western blotting法检测斑马鱼胚胎中的GMFβ蛋白；采用免疫荧光组织染色法检测成年斑马鱼端脑中的GMFβ蛋白。结果 斑马鱼胚胎中GMFβ mRNA在受精3～12 h呈广泛性表达；受精24 h主要表达于眼原基、端脑、间脑、中脑、后脑和脊髓；受精48 h以后主要表达于脑部和视网膜；受精72 h表达强度最高，之后逐渐减弱，受精7 d呈微弱表达。斑马鱼胚胎中GMFβ蛋白在受精3 h开始表达，之后逐渐升高，受精72 h表达强度最高。成年斑马鱼端脑中GMFβ主要表达于背侧端脑和腹侧端脑的背侧核，而腹侧端脑的腹侧核和皮质下区域均未见GMFβ表达。结论 斑马鱼胚胎发育时期GMFβ逐渐集中于脑部，成年后GMFβ阳性细胞主要在端脑的增殖活跃区(中缝和背侧端脑)。

神经胶质成熟因子β；斑马鱼；神经发育；整体原位杂交；蛋白印迹法；免疫荧光组织染色

神经胶质成熟因子(GMF)基因家族在脊椎动物中包括神经胶质成熟因子β(GMFβ)和神经胶质成熟因子γ(GMFγ)两个亚型，它们都是ADF/cofilin超家族蛋白新成员，参与肌动蛋白骨架改装[1～3]。GMFβ是一种相对分子质量为17 kD的高度保守蛋白，它包含约142个氨基酸残基，主要在脊椎动物的大脑表达，部分见于胸腺和小肠[4, 5]。在大脑中GMFβ主要在星形胶质细胞表达，具有营养神经和神经保护作用[6]。近年来大量研究发现GMFβ在星形胶质细胞中通过p38 丝裂原活化蛋白激酶和转录因子NF-κB 调节胞内压力相关信号通路[7, 8]，在神经退行性疾病的脑组织和胶质瘤、卵巢癌组织中表达升高[9～11]，提示GMFβ在脊椎动物中起着复杂的作用。然而，关于GMFβ是否参与神经发育、神经元分化成熟的调控，以及如何调节神经发育和分化的报道却十分少见。因此，研究GMFβ在胚胎的发育过程以及在成年个体中的组织分布，对研究GMFβ在神经发育和神经元分化中发挥的作用具有重要的指导作用。本研究观察了斑马鱼胚胎及成年斑马鱼端脑中GMFβ的表达。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 斑马鱼胚胎、成年斑马鱼端脑标本的制备 性成熟AB野生型斑马鱼由南方医院临床医学实验研究中心斑马鱼养殖室繁殖培养。提前1 d将AB野生型斑马鱼按照雌雄1∶1的比例放入孵化盒中，用隔板将雌雄分开。第二天早晨抽去隔板,雄鱼开始追逐雌鱼,一般15 min左右开始排卵 ,用一个小筛网收取受精卵,流水稍微冲洗后，装到含有美兰的系统水的洁净培养皿中,每皿约50个,放到28.5 ℃培箱中。分别收集受精3、6、9、12、24、48、72 h的斑马鱼胚胎和7 d的斑马鱼幼鱼。受精24 h后的胚胎给予0.003%苯硫脲(PTU)处理阻止黑色素形成。收集的胚胎经固定、梯度甲醛脱水后保存于-20 ℃备用。取3～6个月斑马鱼端脑于4%多聚甲醛内固定过夜，第2天取出端脑用PBS洗5 min，放于包埋盒内。梯度乙醇脱水，二甲苯固定，石蜡包埋，蜡块于-20 ℃保存备用。

1.2 斑马鱼胚胎中GMFβ mRNA的检测 采用胚胎原位杂交技术。取备用的各时点斑马鱼胚胎各20枚，室温下用1× PBST洗去多余甲醇溶液，将胚胎移入68 ℃ 杂交炉中预杂交1 h，然后加入GMFβ基因反义mRNA 探针68 ℃ 杂交过夜。第2天洗去多余的探针后，加入anti-GIG-AP与GMFβ 基因反义mRNA 探针结合过夜。第3天用1×PBST洗去未结合的抗体，再加入BCIP/NBT 溶液显色，显微镜下观察并记录结果后，用70%甘油对杂交胚胎进行再固定并且照相。

1.3 斑马鱼胚胎GMFβ蛋白的检测 采用Western blotting法。取备用的各时点斑马鱼胚胎15～20颗，加入组织蛋白提取液后至匀浆机粉碎匀浆，匀浆后冰浴静置10 min，然后4 ℃离心15 min，取上清液为蛋白提取液。分光光度计测定蛋白量，取30 μg 蛋白提取液，按照体积1∶4加入上样缓冲液，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。然后把分离后的蛋白质转移到PVDF膜上，5%BSA(牛血清蛋白)室温封闭1 h。与兔抗GMFβ抗体(1∶1 000)4 ℃过夜孵育。TBST洗涤后，加入抗兔IgG二抗(1∶7 500)室温孵育1 h。TBST洗涤5 min，重复3次后加入HRP发光液显色,用化学发光成像系统(Image Station in-Vivo F KODAK)拍照。

1.4 成年斑马鱼端脑GMFβ蛋白的检测 取备用的成年斑马鱼端脑标本，脱蜡，微波炉抗原修复20 min。在标本上滴加山羊血清，室温封闭1 h，加入GMFβ兔多克隆抗体(1∶100)4 ℃过夜，次日加入PBST洗3次，每次10 min，加入ALEXA FLUOR 488 山羊抗兔荧光二抗(1∶200)室温放置1 h，加入PBST洗3次，每次10 min，加入DAPI染色液染色15 min，加入PBST洗3次，每次10 min，滴加抗荧光衰减封片剂封片并用共聚焦拍照仪器拍照。

2 结果

2.1 斑马鱼胚胎中GMFβ mRNA和蛋白的表达情况 斑马鱼胚胎中GMFβ mRNA在受精3～12 h呈广泛性表达；受精24 h主要表达于眼原基、端脑、间脑、中脑、后脑和脊髓；受精48 h以后主要表达于脑部和视网膜；受精72 h表达强度最高，之后逐渐减弱，受精7 d呈微弱表达。斑马鱼胚胎中GMFβ蛋白在受精3 h开始表达，之后逐渐升高，受精72 h表达强度最高。

2.2 成年斑马鱼端脑中GMFβ蛋白的表达情况 成年斑马鱼端脑中GMFβ表达于细胞内，且主要集中在斑马鱼背侧端脑(D)和腹侧端脑的背侧核(Vd)，而腹侧端脑的腹侧核(Vv)和皮质下区均未发现GMFβ阳性细胞。

3 讨论

斑马鱼作为一种新兴的动物模型是研究基因功能的有效载体。斑马鱼的分子途径调控高度保守，同时具有体外受精、生殖周期短、生殖能力强、高产卵量、体积小、发育快且胚胎透明等优点，可以高效、连续和动态观察并记录胚胎的发育[12]。通过原位杂交技术和免疫荧光技术我们发现GMFβ在主要在斑马鱼脑部表达，这与哺乳类动物相似。原位杂交结果显示，GMFβ mRNA在受精3～12 h呈广泛性表达；受精24 h主要表达于眼原基、端脑、间脑、中脑、后脑和脊髓；受精48 h之后主要表达于脑部和视网膜，且受精72 h表达最强，之后逐渐减弱，至受精7 d呈微弱表达。这表明在斑马鱼胚胎器官发育形成的过程中，GMFβ一直是高表达的，而在器官发育成型稳定后仅维持微弱的表达。

GMFβ是一个高度保守的蛋白质，最初认为它可以促进脊柱动物的神经元和胶质细胞的生长和分化[13]，通过调节脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)起到神经营养和神经保护的作用[14]。在大鼠上敲除GMFβ后，出现运动性表现和运动性学习能力受损。作为促炎症介质，GMFβ通过调节氧化应激，TNF-α、IL-1β等炎症因子，参与帕金森病和阿尔兹海默病的发生发展[15, 16]。斑马鱼胚胎神经发育的起始时间与原肠胚发育开始的时间同步(约为受精6 h)[17],从受精12 h开始，伴随胚体生长，背侧外胚层内陷形成神经索，发育进入神经胚阶段，也称体节期。到受精16 h(14 体节期)时各主要器官开始发生，神经节分化形成脑的原基。神经系统发育主要从咽裂期(受精24 ～48 h)开始，早期的神经元群体又称为初级神经元，是相对简单神经系统的一部分，分化后能够调节幼鱼的不同运动。受精24 h后，这些初级神经元分化建立了许多投射[18]，神经形成和轴突神经通路的发育在受精48 h时达到最大化[19]，GMFβ阳性信号在受精6～48 h均呈高表达，故笔者推测GMFβ在神经系统的形成和分化中发挥重要的作用。目前并没有相关文献报道GMFβ在神经系统的形成和分化过程的作用，相应的分子机制亦未明。

免疫荧光显示GMFβ主要在成年斑马鱼端脑的背侧区表达，这是第一次发现并报道的。与哺乳动物不同，成年斑马鱼脑损伤后具有神奇的再生功能,这使得斑马鱼成为研究神经再生很好的模型[20]。斑马鱼脑损伤后的神经再生主要由放射状胶质细胞增殖、分化转化成新生神经元并迁移到损伤区域至完全修复。持续的新生神经元生成依赖于足量的放射状胶质细胞数量[21]。在哺乳动物胚胎神经发育过程中放射状胶质细胞具有神经干细胞的功能，但是成年后仅极少量的放射状胶质细胞保留，而成年的斑马鱼端脑中保留了放射状胶质细胞[22, 23]。成年斑马鱼端脑的背侧区是放射状胶质细胞聚集的区域，亦是增殖活跃的区域[24, 25]。本研究结果显示GMFβ阳性细胞主要集中在放射状胶质细胞聚集区域，故笔者猜测GMFβ在放射状胶质细胞中表达，并参与放射状胶质细胞的增殖转化；GMFβ可能参与神经元分化成熟的过程。

中枢神经系统严重的机械性、炎症性、低温损伤等都会有致残的可能，目前并无有效的治疗方法，其缘由皆因哺乳类动物的神经组织损伤后不能再生，只能瘢痕修复所致。神经再生一直是医学领域研究的热点。本研究观察报道了GMFβ在斑马鱼胚胎到成年的表达定位，推测其可能参与神经再生，对研究GMFβ的功能具有指导作用。在后续实验中我们将进一步探讨GMFβ的作用机理，为治疗神经组织损伤提供潜在的靶点。

[1] Nakano K, Kuwayama H, Kawasaki M, et al. GMF is an evolutionarily developed Adf/cofilin-super family protein involved in the Arp2/3 complex-mediated organization of the actin cytoskeleton[J]. Cytoskeleton (Hoboken), 2010,67(6):373-382.

[2] Aerbajinai W, Liu L, Chin K, et al. Glia maturation factor-gamma mediates neutrophil chemotaxis[J]. J Leukoc Biol, 2011,90(3):529-538.

[3] Gandhi M, Smith BA, Bovellan M, et al. GMF is a cofilin homolog that binds Arp2/3 complex to stimulate filament debranching and inhibit actin nucleation[J]. Curr Biol, 2010,20(9):861-867.

[4] Zaheer A, Yorek MA, Lim R. Effects of glia maturation factor overexpression in primary astrocytes on MAP kinase activation, transcription factor activation, and neurotrophin secretion[J]. Neurochem Res, 2001,26(12):1293-1299.

[5] Utsuyama M, Shiraishi J, Takahashi H, et al. Glia maturation factor produced by thymic epithelial cells plays a role in T cell differentiation in the thymic microenvironment[J]. Int Immunol, 2003,15(5):557-564.

[6] Zaheer A, Haas JT, Reyes C, et al. GMF-knockout mice are unable to induce brain-derived neurotrophic factor after exercise[J]. Neurochem Res, 2006,31(4):579-584.

[7] Zaheer A, Lim R. Overexpression of glia maturation factor (GMF) in PC12 pheochromocytoma cells activates p38 MAP kinase, MAPKAP kinase-2, and tyrosine hydroxylase[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1998,250(2):278-282.

[8] Lim R, Zaheer A, Yorek M A, et al. Activation of nuclear factor-kappaB in C6 rat glioma cells after transfection with glia maturation factor[J]. J Neurochem, 2000,74(2):596-602.

[9] Zaheer A, Zaheer S, Sahu SK, et al. A novel role of glia maturation factor: induction of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and pro-inflammatory cytokines[J]. J Neurochem, 2007,101(2):364-376.

[10] Li YL, Ye F, Cheng XD, et al. Identification of glia maturation factor beta as an independent prognostic predictor for serous ovarian cancer[J]. Eur J Cancer, 2010,46(11):2104-2118.

[11] Thangavel R, Stolmeier D, Yang X, et al. Expression of glia maturation factor in neuropathological lesions of Alzheimer's disease[J]. Neuropathol Appl Neurobiol, 2012,38(6):572-581.

[12] 孙智慧，贾顺姬，孟安明. 斑马鱼:在生命科学中畅游[J]. 生命科学,2006,23(5):431-436.

[13] Asai K. Review of the research of glia maturation factor and cloning of human and rat glia maturation factor-gamma (GMFG) cDNA[J]. Nihon Shinkei Seishin Yakurigaku Zasshi, 2001,21(1):15-20.

[14] Pantazis NJ, Zaheer A, Dai D, et al. Transfection of C6 glioma cells with glia maturation factor upregulates brain-derived neurotrophic factor and nerve growth factor: trophic effects and protection against ethanol toxicity in cerebellar granule cells[J]. Brain Res, 2000,865(1):59-76.

[15] Khan MM, Zaheer S, Thangavel R, et al. Absence of glia maturation factor protects dopaminergic neurons and improves motor behavior in mouse model of parkinsonism[J]. Neurochem Res, 2015,40(5):980-990.

[16] Khan MM, Zaheer S, Nehman J, et al. Suppression of glia maturation factor expression prevents 1-methyl-4-phenylpyridinium MPP-induced loss of mesencephalic dopaminergic neurons[J]. Neuroscience, 2014,277:196-205.

[17] Eisen JS. Developmental neurobiology of the zebrafish[J]. J Neurosci, 1991,11(2):311-317.

[18] Parng C, Seng WL, Semino C, et al. Zebrafish: a preclinical model for drug screening[J]. Assay Drug Dev Technol,2002,1(1):41-48.

[19] Morin-Kensicki EM, Eisen JS. Sclerotome development and peripheral nervous system segmentation in embryonic zebrafish[J]. Development, 1997,124(1):159-167.

[20] Marz M, Schmidt R, Rastegar S, et al. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon[J]. Dev Dyn, 2011,240(9):2221-2231.

[21] Onteniente B, Kimura H, Maeda T. Comparative study of the glial fibrillary acidic protein in vertebrates by PAP immunohistochemistry[J]. J Comp Neurol, 1983,215(4):427-436.

[22] Kriegstein A, Alvarez-Buylla A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells[J]. Annu Rev Neurosci, 2009,32(7):149-184.

[23] Noctor SC, Flint AC, Weissman TA, et al. Dividing precursor cells of the embryonic cortical ventricular zone have morphological and molecular characteristics of radial glia[J]. J Neurosci, 2002,22(8):3161-3173.

[24] Grandel H, Kaslin J, Ganz J, et al. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate[J]. Dev Biol, 2006,295(1):263-277.

[25] Adolf B, Chapouton P, Lam CS, et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon[J]. Dev Biol, 2006,295(1):278-293.

吴炳义(E-mail：wubingyi66@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.11.009

R329.2

A

1002-266X(2017)11-0030-03

2016-10-22)