脑胶质瘤组织中酪氨酸激酶受体B表达及其与病理分级的关系

杨海峰，黄淑红

(1北京市仁和医院，北京102600；2山东大学医学院)

脑胶质瘤组织中酪氨酸激酶受体B表达及其与病理分级的关系

杨海峰1，黄淑红2

(1北京市仁和医院，北京102600；2山东大学医学院)

目的 观察脑胶质瘤组织中酪氨酸激酶受体B(TrkB)的表达情况，并探讨其与病理分级的关系。方法 将45例份脑胶质瘤患者手术切除肿瘤组织作为观察组，其中Ⅰ+Ⅱ级18例份(低级别)、Ⅲ+Ⅳ级27例份(高级别)；另取10例份正常脑组织作为对照组，采用实时荧光定量PCR检测两组TrkB mRNA表达，免疫组织化学染色、Western blot法检测两组TrkB蛋白表达，分析脑胶质瘤TrkB蛋白表达与病理分级的关系。结果 观察组、对照组脑组织中TrkB mRNA的相对表达量分别为0.188 1±0.030 1、0.083 5±0.037 4，TrkB蛋白的相对表达量分别为0.955 6±0.063 7、0.448 9±0.072 4，两组相比，P均<0.05。低级别、高级别脑胶质瘤组织中TrkB mRNA的相对表达量分别为0.101 4±0.027 9、0.237 1±0.038 3，TrkB蛋白的相对表达量分别为0.765 3±0.048 1、1.082 5±0.083 5，两者相比，P均<0.05。结论 脑胶质瘤组织中TrkB表达升高，高病理分级较低病理分级TrkB表达高。

脑胶质瘤；酪氨酸激酶受体B；病理分级

脑胶质瘤是常见的中枢神经系统原发性肿瘤，可在脑实质中浸润性生长，侵袭性强，手术很难进行完全切除，且其复发率高、治愈率低、预后差。受体酪氨酸激酶B(TrkB)作为一种癌基因，在神经母细胞瘤组织中高表达[1]，并通过与其配体——脑源性神经营养因子(BDNF)结合激活一系列重要的信号转导通路，进而对肿瘤的发生发展进行调控[2～6]。TrkB作为抗肿瘤治疗的新靶点受到越来越多的关

注，但目前有关TrkB在脑胶质瘤中的作用研究较少。本研究观察了脑胶质瘤组织中TrkB的表达变化，并探讨其与肿瘤病理分级的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 将2013年5月～2015年12月北京市仁和医院45例份脑胶质瘤患者手术切除肿瘤组织作为观察组，均经病理检查确诊。脑胶质瘤患者中男31例、女14例，年龄7～75岁、中位年龄41岁，其中>60岁6例、≤60岁39例。以2007年WHO脑肿瘤分类标准进行分期，其中Ⅰ级9例、Ⅱ

级9例、Ⅲ级13例、Ⅳ级14例。以Ⅰ+Ⅱ级为中低度恶性(低级别)，Ⅲ+Ⅳ级为高度恶性(高级别)。另选10例份同期颅脑外伤术中切除的正常脑组织作为对照组。所有病例术前未进行放、化疗，均有详细的临床资料，本研究方案经医院伦理委员会批准。

1.2 脑组织TrkB mRNA检测 将上述两组部分组织标本用4%中性甲醛进行固定，常规石蜡包埋，4 μm连续切片，保存切片；另外部分标本于-80 ℃冰箱保存。取新鲜冰冻脑胶质瘤组织和正常脑组织，提取RNA，通过反转录得到cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR实验。TrkB mRNA的上游引物：5′-GTCCAGACACTCAGGATTTG-3′，下游引物:5′-TCCTCCACAGTGAGGTTAG-3′。内参GAPDH上游引物：5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，下游引物:5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。反应体系：模板cDNA 2 μL，2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，上下游引物均为0.8 μL，ddH2O 6.4 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸30 s，40个循环。实验重复3次。使用2-ΔΔCt分析法分析TrkB mRNA相对于内参GAPDH的相对表达量。

1.3 脑组织TrkB蛋白检测 ①免疫组织化学染色：对脑胶质瘤及正常脑组织石蜡切片进行免疫组织化学EnVision法染色，具体步骤如下。60 ℃烘烤石蜡切片2 h，切片脱蜡至水；双氧水阻断内源性过氧化物酶，于0.01 mol/L枸橼酸缓冲液中90 ℃微波抗原修复8 min；5%二抗正常血清室温孵育封闭2 h；兔抗人TrkB抗体(1∶200，美国Abcam公司)室温孵育1 h后4 ℃过夜；聚合物增强剂室温孵育20 min，酶标抗鼠聚合物室温孵育25 min，常规DAB显色。以PBS代替一抗作为阴性对照组，同时做空白对照，已知阳性片作为阳性对照，以细胞膜或胞质出现明显的棕色颗粒为阳性细胞，无着色则为阴性。在光学显微镜40×10视野下，每个样本选取5个视野，采用Barnes法统计阳性细胞数，按棕色显色细胞的比例进行计分，<1%计0分、1%～<11%计1分、11%～<51%计2分、51%～<80%计3分、≥80%计4分，将1～4分定义为阳性、0分为阴性。②采用Western blot法。取新鲜冰冻脑胶质细胞瘤组织和正常脑组织按照质量体积比1∶3加入组织裂解液进行裂解，BCA法测定总蛋白浓度，取50 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，随后电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，加一抗兔抗人TrkB抗体/鼠抗人β-tubulin抗体(1∶1 000，美国Sigma公司)4 ℃孵育过夜，洗涤后加二抗HRP标记的抗兔IgG抗体(1∶5 000，美国Abcam公司)孵育1 h，洗膜后ECL化学发光法显色。采用Image J分析所得图像，以TrkB/β-tubulin灰度比值表示TrkB蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 两组脑组织TrkB mRNA表达比较 观察组、对照组脑组织中TrkB mRNA的相对表达量分别为0.188 1±0.030 1、0.083 5±0.037 4，两组相比，P<0.05。

2.2 两组脑组织TrkB蛋白表达比较 免疫组化染色结果显示TrkB蛋白在脑组织胞质中呈棕色颗粒状。观察组TrkB蛋白表达1、2、3、4分分别为4、2、12、27例，对照组分别为8、2、0、0例，两组比较P<0.05。Western blot结果显示，观察组、对照组脑组织中TrkB蛋白的相对表达量分别为0.955 6±0.063 7、0.448 9±0.072 4，两组相比，P<0.05。

2.3 脑胶质瘤TrkB表达与病理分级的关系 低级别、高级别脑胶质瘤组织中TrkB mRNA的相对表达量分别为0.101 4±0.027 9、0.237 1±0.038 3，TrkB蛋白的相对表达量分别为0.765 3±0.048 1、1.082 5±0.083 5，两者相比，P均<0.05。

3 讨论

脑胶质瘤为颅内最常见的肿瘤，发病率高，恶性程度高。虽然近几年脑胶质瘤的治疗技术迅速发展，但目前其临床治疗效果仍不满意[7]。目前，靶向治疗作为一种新兴的治疗方法逐渐应用于胶质瘤治疗。研究[8,9]发现，一些非编码RNA对靶向治疗神经胶质瘤具有良好的治疗效果。除此之外，一些在肿瘤发生发展过程中的关键基因也是重要的分子靶点，现已证明血管内皮生长因子(VEGF)、纤维母细胞生长因子是常用的抑制肿瘤血管生长的重要靶点[10]，与VEGF作用的单克隆抗体药物贝伐珠单抗现已用于复发性胶质母细胞瘤的治疗[11,12]。

TrkB是BDNF的高亲和力特异性受体，TrkB与BDNF结合后会发生磷酸化而被激活[13]，活化的TrkB可以诱导PI3K的活性，导致Akt的激活，进而通过PI3K/Akt信号通路调控细胞增殖、生长等生理活动[3～5]；TrkB/BDNF还可以激活MAPK和PLC信号转导途径，这三条信号转导途径密切调控着肿瘤细胞的增殖、浸润转移等。越来越多的研究表明，TrkB/BDNF与肿瘤的发生发展进程密切相关，TrkB/BDNF信号途径的激活会刺激肿瘤细胞的增殖、浸润及转移，促进肿瘤血管的发生，同时还会抑制肿瘤细胞的失巢凋亡[14]。TrkB在多种实体瘤中过表达，如肺癌[6]、鼻咽癌、舌鳞状细胞癌[15]、食管鳞癌[16]、肝癌[17]、结肠癌[18]、子宫内膜癌[19]等。TrkB在神经母细胞瘤中异常高表达，并能促进神经母细胞瘤的扩散和浸润能力[20,21]。在鼻咽癌中，高表达的TrkB通过介导肿瘤细胞的失巢凋亡增强肿瘤细胞的化疗耐药性[14,22]。因此，TrkB作为一种原癌基因，在恶性肿瘤生成机制中的作用越来越受到重视，并且研究认为TrkB可以作为抗肿瘤靶向治疗的新靶点[14]。本研究观察了脑胶质瘤组织中TrkB蛋白的表达变化，发现TrkB在脑胶质瘤组织中异常高表达，且在高病理分级的脑胶质瘤组织中表达量明显高于低病理分级，不管是在mRNA水平还是蛋白水平，这与Xiong等[21]的研究结果一致。除此之外，脑胶质瘤组织中TrkB的异常高表达与患者的年龄、性别无关，但与病理分级有关，且病理分级越高TrkB表达量越高，表明TrkB的异常高表达可能与脑胶质瘤的发生发展密切相关，TrkB可能在脑胶质瘤由低级向高级转变的过程中发挥重要作用。有研究[23]表明，卵巢上皮癌中TrkB的过表达使PI3K/Akt信号通路过度激活，导致恶性肿瘤的侵袭性及转移性增强。关于TrkB影响脑胶质瘤发生发展的分子机制还需要进一步的实验来探索。

综上可见，脑胶质瘤组织中TrkB表达升高，高病理分级较低病理分级TrkB表达高。抑制TrkB的过表达可能对脑胶质瘤的治疗提供帮助。

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(收稿日期：2016-09-06)

国家自然科学基金资助项目(31271519)。

黄淑红(E-mail： huangshdoctor@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.02.020

R739.41

B

1002-266X(2017)02-0060-03

2016-09-05)