兔眼视网膜神经上皮层下内界膜移植转归观察

吴鹏，高荣玉，徐鑫彦，张杰，任建涛，韩海涛，黄旭东

(潍坊眼科医院 国家临床重点专科建设项目单位，山东潍坊261041)

兔眼视网膜神经上皮层下内界膜移植转归观察

吴鹏，高荣玉，徐鑫彦，张杰，任建涛，韩海涛，黄旭东

(潍坊眼科医院 国家临床重点专科建设项目单位，山东潍坊261041)

目的观察兔眼视网膜神经上皮层下人眼内界膜移植的转归情况。方法选择特发性黄斑裂孔患者6例，采用常规23G经睫状体平坦部无缝合三通道玻璃体切割手术进行内界膜剥除，将剥除的内界膜置入5- (4,6- 二氯三嗪基)氨基荧光素中染色，磷酸盐缓冲液漂洗后备用。选择青紫蓝兔6只，速眠新Ⅱ注射液麻醉后行23G无缝合常规三通道经睫状体平坦部玻璃体切除术。切除晶状体，保留晶状体前囊膜，应用4 mg/0.1 mL曲安奈德染色玻璃体后将其切除,然后行人工视网膜脱离，脱离范围约1 PD范围，在脱离的视网膜边缘部作一长约1.5 mm的条形裂孔，将染色好的人眼视网膜内界膜填塞入脱离的视网膜神经上皮层下方。分别于术后3、10、30天采集术眼眼底彩色图像及光学相干断层扫描(OCT)图像，观察移植物情况；采集图像后，各时间点处死内界膜移植片在位兔1只，制备快速冰冻病理切片，使用共聚焦显微镜观察神经上皮层下的内界膜变化。结果术后3天眼底彩色图像及OCT图像可见4只兔内界膜移植片在位、2只兔出现视网膜脱离导致内界膜移植片移位，激光共聚焦显微镜下可见黄绿色荧光条带；术后10天，眼底彩色图像可隐约观察到内界膜移植成功的4只兔视网膜下浅黄色内界膜移植片，OCT图像可观察到移植的内界膜片段，激光共聚焦显微镜下可见黄绿色荧光条带片段化。术后30天，眼底彩色图像及OCT图像中内界膜移植片均已不可辨认，黄绿色荧光条带消失。结论移植入兔眼视网膜神经上皮层下的人眼视网膜内界膜最终被降解吸收，不会在视网膜下形成永久性瘢痕。

特发性黄斑裂孔；内界膜移植；视网膜神经上皮；兔

黄斑裂孔是指黄斑部视网膜内界膜至感光细胞层发生的组织缺损，是一种严重损害视功能的疾病。玻璃体切割联合内界膜剥除术后惰性气体填充是目前治疗黄斑裂孔最主要的手段，可使黄斑裂孔闭合率达到90%以上。但对于特发性黄斑裂孔，如巨大黄斑裂孔、高度近视性黄斑裂孔、第一次手术后未闭合的黄斑裂孔等，如按常规方法治疗，裂孔闭合率较低[1]。研究证实，内界膜移植可诱导神经胶质细胞桥样增殖，促进黄斑裂孔闭合，并驱使光感受器细胞复位，继而促进视功能恢复[2，3]。但内界膜是muller细胞的基底膜，主要成分是Ⅳ型胶原纤维，可在胶原酶的作用下降解，亦可形成瘢痕组织，故移植入裂孔内的内界膜转归情况存在争议。为此，我们于2016年12月～2017年1月进行了如下研究。

1 材料与方法

1.1 材料 健康青紫蓝兔6只，雌雄不限，3月龄，体质量(1.3±0.8) kg。Accrus玻切机，美国爱尔康公司；Resight非接触式广角系统，德国蔡司公司；Spectralis OCT，德国海德堡公司；直接眼底镜，苏州六六视觉科技股份有限公司。速眠新Ⅱ注射液，军事医学科学院军事兽医研究所；5- (4，6- 二氯三嗪基)氨基荧光素(5- DTAF)，美国AAT Bioquest公司；磷酸盐缓冲液、硅油，美国博士伦公司；曲安奈德，昆明积大制药股份有限公司；OCT胶，重庆医科大学基础医学研究所；盐酸罗哌卡因，瑞典阿斯利康制药有限公司。

1.2 人眼视网膜内界膜获取和制备 选择经裂隙灯、光学相干断层扫描(OCT)等检查确诊，需行玻璃体切割联合内界膜剥除手术治疗的特发性黄斑裂孔患者，排除重大全身性疾病(如严重心力衰竭)而不能承受眼部手术者，共纳入患者6例。所有患者签署手术协议书，由同一名具有丰富经验的眼科医师切除视网膜内界膜。患者经盐酸罗哌卡因球后麻醉，在Resight非接触式广角系统下，完成常规23G经睫状体平坦部无缝合三通道玻璃体切割手术。于中央玻璃体完全切除后玻璃体腔内注射4 mg/0.1 mL曲安奈德染色，剥除以黄斑裂孔中心为圆心约2 PD范围内的内界膜。将剥除的内界膜置入预先用0.2 mol/L NaHCO3配置的0.5% DTAF溶液中染色1 min，磷酸盐缓冲液漂洗后呈浅黄色[4]，说明人眼视网膜内界膜制备成功。

1.3 兔视网膜裂孔模型制作及人眼视网膜内界膜植入 手术操作由同一名眼科医师完成。所有实验兔适应性喂养7天，术前臀部肌肉注射速眠新Ⅱ注射液0.01 mg/kg麻醉。麻醉完全后，于Resight非接触式广角系统下完成晶状体切除联合常规23G经睫状体平坦部无缝合三通道玻璃体切割手术。基本步骤：23G巩膜穿刺刀作常规三通道巩膜穿刺口，放置套管并进行玻璃体腔灌注；玻切头切除晶状体，保留晶状体前囊膜；4 mg/0.1 mL曲安奈德染色玻璃体后将其切除；38G针头在其下方后极部视网膜下注入灌注液，行人工视网膜脱离，脱离范围为穿刺点周围约1 PD；用视网膜剪刀在脱离的视网膜边缘作一长约1.5 mm的条形裂孔，将人眼视网膜内界膜植入脱离的视网膜神经上皮层下方；行气-液交换后在裂孔表面注射粘弹剂，视网膜复位后注入硅油。术毕球结膜下立即注射妥布霉素40 mg、地塞米松2.5 mg，术后1个月内典必殊眼膏涂结膜囊、4次/d，阿托品眼膏涂结膜囊、2次/d。

1.4 相关指标观察 术后1个月内每2～3天，裂隙灯下检查眼部情况并观察眼内炎症反应情况，直接眼底镜观察眼底情况。术后3、10、30天采集术眼眼底彩色图像及OCT图像，观察移植物情况；采集图像后，每个时间点空气栓塞处死内界膜移植片在位实验兔1只，取眼球术区视网膜和球壁组织，立即制备冰冻切片，切片厚度8 μm，切片经4 μg/mL PI溶液常温避光孵育15 min，PBS冲洗3 min×5次，PBS- 甘油封片，激光共聚焦显微镜下观察照相。5- DTAF标记的内界膜组织呈黄绿色荧光，PI标记的细胞核呈红色荧光。

2 结果

术后1个月内，所有实验兔眼内无炎症反应发生，玻璃体腔内硅油安静。术后3天直接眼底镜观察到4只实验兔内界膜移植片在位、2只实验兔出现视网膜脱离导致内界膜移植片移位，眼底彩色图像及OCT图像证实直接眼底镜观察结果。激光共聚焦显微镜下可见黄绿色荧光条带。术后10天，4只内界膜移植成功实验兔眼底彩色图像可隐约观察到视网膜下浅黄色内界膜移植片，OCT图像可见移植的内界膜片段，激光共聚焦显微镜下可见黄绿色荧光条带片段化。术后30天，4只内界膜移植成功实验兔眼底彩色图像及OCT图像中内界膜移植片均已不可辨认，黄绿色荧光条带消失。见插页Ⅱ图3～5。

3 讨论

玻璃体切割手术联合内界膜剥除后惰性气体填充，可使黄斑裂孔闭合率达到90%以上。但对于第一次手术后未闭合的黄斑裂孔、直径巨大的黄斑裂孔、高度近视性黄斑裂孔等特发性黄斑裂孔，常规手术裂孔闭合率较低。国内外学者采用多种方法来提高其闭合率，如Alpatov等[5]在玻切手术中使用机械性推压黄斑裂孔周围视网膜使黄斑裂孔缩小；Charles等[6]在手术中于黄斑颞侧行全层视网膜切开，以达到松解的目的；Reis等[7]在黄斑裂孔边缘外1 PD范围作5条向心性切口，切口深度达到视网膜色素上皮细胞层，视网膜切开的目的是松解黄斑裂孔周围组织的牵拉，促进黄斑裂孔闭合。但上述方法均未取得预期效果。

目前，内界膜移植治疗特发性黄斑裂孔成为临床研究的热点[2，8]。其核心技术是将部分视网膜内界膜移到黄斑裂孔内，将黄斑裂孔区域暴露的视网膜色素上皮覆盖。其促进黄斑裂孔闭合的机制：①黄斑裂孔内植入内界膜可恢复原来相对封闭的环境，通过Na+- K+- ATP酶将视网膜下液体转运到裂孔外，使视网膜恢复贴附，从而促进裂孔闭合[9]；②巨噬样细胞激活muller细胞诱导神经胶质细胞增生[10～12]，而内界膜内有muller细胞片段，移植的内界膜可促进视网膜内及内界膜移植片表面的胶质细胞增殖，利用内界膜作为支架，最终促进裂孔闭合。此外，Muller细胞承担着传递光线从视网膜表层到光感受器细胞层的作用[13，14]。有文献报道，对直径大于400 μm的黄斑裂孔患者行内界膜移植术后，裂孔闭合率高于行内界膜剥除患者[15]。目前对内界膜移植入黄斑裂孔内的转归存在争议。有研究认为，移植的内界膜很快降解，其不仅能促进黄斑裂孔闭合，还可促进视功能恢复；也有研究认为，内界膜移植后，黄斑裂孔区厚度较未行内界膜移植的黄斑裂孔区厚，说明内界膜移植后黄斑裂孔的闭合是瘢痕闭合，可阻碍视功能的恢复。

文献报道，人眼黄斑区视网膜平均厚度为215 μm[16，17]，而兔眼视网膜平均厚度约为113 μm[18，19]，相对较薄，其内界膜难以剥除。本研究曾尝试剥除兔眼视网膜内界膜，但未能成功，故选用人眼视网膜内界膜代替。本研究结果显示，术后3、10天均发现兔眼视网膜神经上皮层下被染色的内界膜移植片，随时间延长，其呈现片段化，呈现逐渐降解状态；而术后30天时未发现黄绿色荧光，证明内界膜作为Ⅳ型胶原纤维最终被降解。本研究间接证实了填塞入黄斑裂孔的内界膜可作为支架，促进胶质细胞增殖，待黄斑裂孔闭合后最终被降解。文献报道，黄斑裂孔的闭合时间一般为3天[20，21]；对于裂孔较小、易于闭合的黄斑裂孔，内界膜移植并不能加速闭合，反而可能将其作为异物，阻碍视细胞向裂孔中心复位，不利于黄斑裂孔闭合及视功能的恢复，但对于巨大的特发性黄斑裂孔是有助于裂孔闭合的，这为内界膜移植的适应证提供了依据。此外，移植过程中应将内界膜尽量修理至与裂孔直径相当，这样可加速黄斑裂孔闭合过程中内界膜的降解速度。

总之，我们认为兔眼视网膜神经上皮层下植入的人眼内界膜可作为胶质细胞增殖的临时支架，最终会被降解吸收，不会在视网膜下形成永久性瘢痕。

[1] 贺峰，张潇，董方田.视网膜内界膜移植治疗复发性黄斑大裂孔一例[J].中华眼科杂志，2013，49(6)：551- 552.

[2] 曹维，韩泉洪.内界膜翻瓣手术治疗黄斑裂孔的应用[J].眼科新进展，2016，32(8)：731- 734.

[3] OH J, Yang SM, Choi YM, et al. Glial proliferation after vitrectomy for a macular hole: a spectral domain optical coherence tomography study[J]. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 2013,251(2):477- 484.

[4] Connon CJ, Nakamura T, Quantock AJ, et al. The persistence of transplanted amniotic membrane in corneal stroma[J]. Am J Ophthalmol, 2006,141(1):190- 192.

[5] Alpatov S, Shchuko A, Malyshev V. A new method of treatingmacular holes[J]. Eur J Ophthalmol, 2007,17(2):246- 252.

[6] Charles S, Randolph JC, Neekhra A, et al. Arcuate retinotomy for the repair of large macular holes[J]. Ophthalmic Surg Lasers Imaging Retina, 2013,44(1):69- 72.

[7] Reis R, Ferreira N, Meireles A. Management of Stage Ⅳ Macular holes: when standard surgery fails[J]. Case Rep Ophthalmol, 2012,3(2):240- 250.

[8] Shin MK, Park KH, Park SW, et al. Perfluoro- n- octane- assisted single- layered inverted internal limiting membrane flap technique for macular hole surgery[J]. Retina, 2014,34(9):1905- 1910.

[9] 吴鹏，黄旭东，孙先勇，等.内界膜剥除及其联合内界膜移植治疗特发性黄斑裂孔的疗效对比观察[J].中华眼底病杂志，2014，30(3)：253- 256.

[10] Caicedo A, Espinosa- Heidmann DG, Pina Y, et al. Blood- derived macrophages infiltrate the retina and activate Muller glial cells under experimental choroidal neovascularization[J]. Exp Eye Res, 2005,81(1):38- 47.

[11] Winkler J, Hagelstein S, Rohde M, et al. Cellular and cytoskeletal dynamics within organ cultures of porcine neuroretina[J]. Exp Eye Res, 2002,74(6):777- 788.

[12] Fernandez- Bueno I, Pastor JC, Gayoso MJ, et al. Muller and macrophage- like cell interactions in an organotypic culture of porcine neuroretina[J]. Mol Vis, 2008(14):2148- 2156.

[13] Franze K, Grosche J, Skatchkov SN, et al. Muller cells are living optical fibers in the vertebrate retina[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2007,104(20):8287- 8292.

[14] Chang YC, Lin WN, Chen KJ, et al. Correlation between the dynamic postoperative visual outcome and the restoration of foveal microstructures after macular hole sugery[J]. Am J Ophthalmol, 2015，160(1):100- 106．

[15] 孙会兰，谢立科，郝晓风，等.特发性黄斑裂孔的临床研究进展[J].国际眼科杂志，2017，17(2)：259- 262.

[16] 周娜磊，安建斌，马景学，等.SD- OCT对正常人黄斑区视网膜厚度容积测量分析[J].中国实用眼科杂志，2015，33(2)：142- 145.

[17] Gao X, Guo J, Meng X, et al. A meta- analysis of vitrectomy with or without internal limiting membrane peeling for macular hole retinal detachment in the highly myopic eyes[J]. BMC Ophthalmol, 2016(16):87.

[18] 骆荣江，葛坚，郭彦，等.兔眼视网膜厚度的光学相干断层扫描测量与组织学检查的相关性研究[J].中华眼底病杂志，2000，16(2)：111- 113.

[19] Pilli S, Zawadzki RJ, Werner JS, et al. Visual outcome correlates with inner macular volume in eyes with surgically closed macular hole[J]. Retina, 2012,32(10):2085- 2095.

[20] Hasler PW， Prunte C. Early foveal recovery after macular holes surgery[J]．Br J Ophthalmol， 2008，92(5)：645- 649.

[21] 吕林.认识特发性黄斑裂孔分类及治疗新趋势、提升特发性黄斑裂孔诊断治疗水平[J].中华眼底病杂志，2017，33(4)：333- 335.

山东省自然科学基金资助项目(ZR2013HM108)。

黄旭东(E- mail： hxd3333@163.com)

10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.36.009

R774.5

A

1002- 266X(2017)36- 0031- 03

2017- 08- 05)

文后参考文献的著录方法

按GB/T7714- 2005《文后参考文献著录规划》采用顺序编码制著录，依照其在文中出现的先后顺序用阿拉伯数字加方括号标出。参考文献中的作者1～3名全部列出，3名以上只列前3名，后加“，等”或其他与之相应的文字。外文期刊名称用缩写，以《Index Medicus》中的格式为准；中文期刊用全名。论文题目后加文献类型及标识，如专著[M]、期刊文章[J]等。每条参考文献均须著录起止页。作者必须认真核对参考文献原文，无误后将其按引用顺序(用阿拉伯数字)排列于文末。