小脑发育相关信号通路研究进展

郭志宝，宿英英

小脑发育相关信号通路研究进展

郭志宝，宿英英

小脑是协调本体感觉-运动的重要器官，还参与认知、情感和语言处理等高级神经活动。哺乳动物成年小脑细胞层次分明，细胞种类少、形态独特，各种细胞在小脑内定位明确，并且表达各自特异性的蛋白标记物。小脑具备的上述特征，已使其成为近年来神经科领域内研究神经发生和细胞生物学行为及其相关信号通路的理想模型。

小脑；发育；信号通路；综述

小脑是协调本体感觉-运动的重要器官。最近的研究表明小脑还参与认知、情感和语言处理等高级神经活动[1-3]。小脑发育受细胞内外多种信号分子的调控，这些信号分子在小脑的神经发生和分叶形成、细胞的增生、分化、迁移等方面起到重要的调节作用。本文就小脑发育过程中起重要作用的信号分子及其相关通路做一综述。

1 Notch 信号通路与小脑发育

Notch 信号通路由 Notch 受体、Notch 配体（Delta，Serrate，Lag-2）和转录协同因子 CSL（CBF1，Suppressor of hairless，Lag-1）、目的基因（如 Hes）组成。当 Notch 受体和相邻细胞表面的 Notch 配体结合后，Notch 受体依次被蛋白酶体切割，释放出具有核定位 信 号 的 胞 质 区 ICN（intracellular domain of Notch），进入胞核与 CLS 结合，使 CLS 从转录抑制状态转变为转录活化状态，最终启动目的基因表达[4]。在 Notch 受体活化过程中，蛋白酶体对 Notch的依次切割具有重要作用。Notch 的活化需要 3 个位点（S1，S2，S3）的依次切割，S1 位点切割由 furinlike convertase 完成，α-secretase 参与对 Notch 的 S2位点的切割，S3 位点切割由 γ-secretase 所完 成[4]。

Notch 信号通路在神经系统发育过程中起到重要的作用。在胚胎发育早期，神经上皮细胞的分化及细胞命运的决定由精确的调控机制完成。研究表明Notch信号通路在脊椎动物神经发生过程中起到关键的作用[5],其作用之一就是能够使早期的前体细胞保持未分化的状态[6]，同时通过“侧向抑制”作用调控神经前体细胞的分化，最终使成熟神经元和胶质细胞在成年脊椎动物神经系统中保持适当的比例[7,8]。当 Notch 信号通路发生异常改变时，比如过表达内源性活化形式的notch受体或配体可抑制神经前体细胞的分化，降低发育早期的神经发生[6,9]；相反，当过表达结构域敲除形式的 Delta 配体可抑制 Notch 信号通路致使神经前体细胞分化提前[10,11]。.

以小鼠NotchⅠ受体为例，其最早在胚胎第9天开始表达于神经上皮细胞，然后在室区和室管膜下区细胞中持续性表达[12]。NotchⅠ基因突变的小鼠发育停止在胚胎 4～6 体节时期，并且在胚胎第 9.5天死亡[13,14]。为了进一步研究 NotchⅠ基因在小脑发育过程中的作用，研究者用条件性基因敲除系统特异性敲除中脑-后脑交界处（小脑原基所在处）神经前体细胞NotchⅠ基因，发现敲除小脑神经上皮细胞NotchⅠ基因导致神经发生提前，NotchⅠ缺失的神经细胞前体细胞不能分化成为成熟的神经元（如颗粒细胞和浦肯野细胞），这些细胞发生凋亡被清除体外；同时NotchⅠ缺失的胶质细胞前体细胞也不能分化成为成熟的胶质细胞，最终使得成年小鼠小脑体积和细胞的数量大大减少[15]。同样，当 Notch 信号通路其他构成部分发生异常时，小脑的正常发育也受到影响。JaggedⅠ（JAGⅠ）是 notch 受体的配体之一，人类 JAGⅠ基因突变会导致 Alagille 综合征，它是一种常染色体隐形遗传性疾病，病变可以累积肝脏、心脏、肾、骨骼肌等 多种器官和 组织[5,16,17]。研究者用条件性基因敲除技术敲除小鼠胚胎发育中期小脑原基处神经上皮细胞 JAGⅠ基因，结果表明 JAGⅠ基因对于小脑颗粒细胞的迁移和 Bergmann 胶质细胞的分化及成熟起到重要的作用，JAGⅠ基因缺失的颗粒细胞不能正常的内迁入内颗粒细胞层，异常聚集在外颗粒细胞层表面；JAGⅠ基因缺失的Bergmann 胶质细胞的放射状突起不能与脑膜形成终足结构，同时细胞的数目也较对照组明显减少；另外，颗粒细胞前体细胞发生异位分化，细胞凋亡增加[18]。同样，Notch 信号通路中 RBP-J基因突变会导致Bergmann胶质细胞的分化成熟障碍，主要表现为Bergmann胶质细胞不能形成规则的单分子层，胞体错乱定位，放射状突起排列紊乱[19]。以上的研究表明在中枢神经系统（central nervous system，CNS）发育的不同时期，Notch信号通路所起到的主要作用也有所不同。在胚胎发育的早期Notch信号通路能够使前体细胞保持未分化状态，起到决定细胞命运的作用，最终使胶质和神经元在成年动物的CNS中保持合适的比例；出生后则能促进细胞的分化、迁移和成熟，在CNS结构的建立和功能的行使方面起到不可替代的作用[5,20-22]。

综合以上的研究结果表明 Notch 信号通路在小脑发育过程中对放射状胶质细胞的形成及其向 Bergmann 胶质细胞分化和颗粒细胞的正确内迁起到至关重要的作用。那么 Notch信号通路是通过怎样的机制或者Notch信号通路下游有哪些信号分子参与这些过程呢？

进一步的研究表明在小脑发育过程中神经元和胶质细胞之间的接触对于放射状胶质细胞的形成起到非常重要的作用。Hatten 等[23]最早的研究表明神经元和胶质细胞的接触可诱导小脑的星形胶质形态上向放射状胶质细胞转化，并且诱导形成的放射状突起能够为颗粒细胞内迁提供支架。随后的研究发现小脑颗粒细胞在向内迁移的过程中可诱导放射状胶质细胞表达其蛋白标记物 BLBP[24]。最近的研究表明放射状胶质细胞的分化依赖于 NotchⅠ受体的激活和后继的下游转录事件，当胶质细胞表面的 NotchⅠ受体和神经元表面的 JaggedⅠ配体结合后激活 Notch 信号通路，通过经典的 Su(H)依赖性和非经典 Deltex1依赖性途径，最终可以诱导胶质细胞表达BLBP和受体酪氨酸激 酶 erbB2[25,26]。 上 调 blbp 表达 可 以增加 迁 移 中 的颗粒细 胞 和放射状胶质细胞之间的粘附力，促进颗粒细胞的内迁[24]，上调胶质细胞 erbB2 受体的表达可增强对其配体 Neuregulin 1（NRG 1）的敏感性，NRG1-erbB2 受体信号通路可诱导星形胶质向放射状胶质转化[25]。简而言之，Notch 信号通路是通过其 NotchⅠ受体的激活而被启动，最终诱导胶质细胞 BLBP 和 erbB2 受体的表达，前者有利于颗粒细胞的内迁，后者通过与其配体结合激活NRG1-erbB2 受体信号通路促进星形胶质向放射状胶质细胞形态的转化。因此，放射状胶质细胞的形态分化和颗粒细胞的向内迁移是一个紧密不可分的过程，即颗粒细胞的内迁可以诱导放射状胶质细胞的形成，放射状胶质细胞的存在又是颗粒细胞内迁不可或缺的前提。

2 Integrin 信号通路与小脑发育

整合素家族（integrins family）是一类跨膜受体，其主要的功能是介导细胞与细胞外基质间以及特定细胞间的粘附。每个整合素分子都是由α、β 2 条链以非共价键形式连接组成的异源二聚体，并且每条链都 包含胞外区、跨膜区 和胞浆区 3 部分[27,28]。目前已知至少有18种α亚单位和8种β亚单位，不同的α亚单位和β亚单位组合构成至少24种整合素分子。整合素分子是通过识别配体分子中由数个氨基酸组成的短肽序列而与配体结合。不同的整合素分子可能识别相同的短肽序列或同一个配体中不同的短肽序列，由于不同的配体可能包含相同的段肽序列，因此每一种整合素分子可能有多种不同的胞外配体，而每一种胞外配体也可能被几种不同的整合素分子所识别。根据整合素分子识别配体分子中短肽序列的不同，可将整合素分为3类：识别精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的整合素分子，如 α5β1、αvβ 1、αvβ6等；识别非RGD序列的整合素分子，如α2β1、αⅡbβ3、α 4β7等；识别序列尚未明确的整合素分子，如α1β1、α8β1、αvβ8等[27]。研究表明整合素和其配体结合介导的信号通路不仅在细胞粘附方面发挥重要的作用，同样在细胞的增殖和存活、迁移、分化及细胞周期调控方面也起到重要的作用[27,28]。

Integrin 信号通路在小脑细胞的增生、迁移、分化等方面也发挥了重要的调控作用[29-32]。以 β1-class 整合素为例阐述 integrin 分子在小脑发育过程中起到调节作用。现有研究表明至少有 12 种不同的 integrin 分子以 β1 为共同的亚基，并且小脑神经元和胶质细胞也表达几种不同的 β1-class整合素分子[33]。研究者利用条件性基因敲除技术敲除中枢神经系统神经元和胶质细胞的β1基因，结果发现β1基因敲除导致小脑发育的异常。主要表现为部分β1基因敲除鼠在出生后很快死亡，但是绝大部分敲除鼠能够存活到成年期，但是β1基因敲除小鼠发育迟缓，伴有共济失调，小脑体积较同窝对照鼠明显减小，并且出现无脑沟和脑回畸形；解剖学上观察，β1基因敲除的小鼠小脑在出生后4天左右开始出现相邻脑叶融合，随着发育进行，脑叶不能进一步向内加深、扩展，最终小脑的体积缩小，IGL层发育差，部分颗粒细胞聚集在相邻脑叶融合的交线处或脑膜浅表面，但是整个小脑的分层基本完好；胶质细胞的终足形成障碍，胶质细胞突起不能伸展到脑膜表面形成终足，而是终止于分子层中；但是β1基因敲除不影响神经元和胶质细胞之间的相互作用。这些研究表明在小脑皮质发育过程中，β1基因对于小脑皮质的细胞层次构建以及脑叶的形成起到重要的调节作用，并且认为颗粒细胞出现迁移障碍主要是由于胶质网络遭到破坏所致[34]。随后的研究发现颗粒细胞前体细胞表达的β1整合素对于颗粒细胞的增殖起到重要的调节作用，并且这一作用是通过 β1-integrin-laminin（层连蛋白)-Shh（音速刺猬蛋白）相关信号通路完成[30]。另外，研究发现小脑胶质细胞表达的β1整合素及其下游的相关蛋白激酶（主要是丝氨酸和苏氨酸激酶）对小脑 Bergmann胶质细胞的分化成熟及小脑皮质层次的构建起到重要的作用[32]。

以上研究表明以 β1 整合素为代表的 integrin 分子在小脑的发育过程中起到重要的调节作用，尤其是在小脑皮质分层、脑叶的形成、颗粒细胞前体细胞的增殖以及Bergmann胶质细胞的分化成熟等方面[30,32,34]。

3 Wnt/β-catenin 信号通路与小脑发育

Wnt蛋白是一种分泌型糖蛋白，可以通过自分泌或旁分泌的方式发挥作用。Wnt的受体是卷曲蛋白（frizzled，Frz），为 7次跨膜蛋白，结构与G蛋白偶联型受体类似。当Wnt与Frz胞外端结合后，可以激活与 Frz 胞内端相连的蓬乱蛋白（Dishevelled，Dvl），激活的 Dvl能够解聚 β-连锁蛋白（β-catenin）的降解复合体（主要由 APC、Axin、GSK-3β、CK1 等构成），从而使胞浆中 βcatenin 积累，并进入胞核，与 T 细胞因子或淋巴细胞增强因子（T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF）相互作用，调节靶基因的表达。Wnt信号通路的激活还需要另外一 受体即低密度脂蛋白受体相关蛋白 5/6，（LDL-receptor-related protein，LRP），但至今仍不清楚它如何与Frz一起活化Dsh。经典的Wnt信号途径可概括为：Wnt→Frz→Dvl→β-catenin 的降解复合体解散→β-catenin 在胞浆积累并进入胞核→TCF/LEF→基因转录（如 c-myc、cyclinD1）[35,36]。

既往的研究表明，Wnt信号通路在胚胎早期发育起到重要的作用，它在细胞命运选择、增殖和分化、极性和运动以及细胞凋亡都有调节作用。在胚胎发育早期敲除小鼠 β-catenin 基因会导致小脑缺失，或引起小脑脑室区神经前体细胞的分化异常，小鼠在胚胎晚期或出生后不久就死亡[37,38]。最近，研究者借助条件性基因敲除技术特异性敲除神经细胞 β-catenin 基因，结果发现βcatenin 基因敲除小鼠小脑分叶和皮质发育异常，同时伴有小脑胶质细胞的分布异常、浦肯野细胞的迁移障碍、颗粒细胞的增殖和分化异常等，这些结果提示 β-catenin 基因对小脑的发育起到至关重要的作用[39]。另外 β-catenin 能够与钙粘素(Cadherin)结合，形成 Cadherin/β-catenin 复合体，参与小脑细胞的粘附和迁移过程[40]。

此 外 ，SHH(Sonic Hedgehog Homolog)[41-43]、L1[44,45]、ephrin/ Eph[46,47]等分子及其相关的信号通路在小脑发育过程中也发挥重要的调控作用。越来越多的研究表明上述信号分子及其相关的信号通路在小脑发育过程是相互影响和协同作用的。例如，Hedgehog(Hh)、Notch 和 Wnt信号通路协同调控小脑正常发育，研究发现当下调Hh信号通路时，Notch和Wnt信号通路的受体、配体以及靶基因如 Notch2,Jagged1,Hes1,mSfrp1 和 mFrz7 等表达也明显下调；相反，上调 Hh信号通路时，Notch 和Wnt信号通路也随之激活[48-50]。

总之，小脑的发育受细胞内外多种信号分子的调控，这些信号分子在小脑的神经发生、细胞的增生、分化、迁移及小脑分叶形成等不同环节起到重要的调节作用，其中以 Notch、Wnt/βcatenin、Integrins、SHH、L1 和 ephrin/Eph 等分子为代表。

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R741；R741.02

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2017.03.018

首都医科大学宣武医院神经内科重症监护病房北京 100053

国家自然科学基金（No.81400931）

2016-12-25

宿英英tangsuyingying@sina.com