2株促进沉香形成的色二孢(Lasiodiplodiatheobromae)的生物学特性研究

陈旭玉,刘洋洋,刘培卫,彭德乾,魏建和*

(1.中国医学科学院﹠北京协和医学院 药用植物研究所,北京 100193;2.中国医学科学院﹠北京协和医学院 药用植物研究所 海南分所/海南省南药资源保护与开发重点实验室,海南 万宁 570311)

2株促进沉香形成的色二孢(Lasiodiplodiatheobromae)的生物学特性研究

陈旭玉1,2,刘洋洋1,2,刘培卫2,彭德乾2,魏建和1,2*

(1.中国医学科学院﹠北京协和医学院 药用植物研究所,北京 100193;2.中国医学科学院﹠北京协和医学院 药用植物研究所 海南分所/海南省南药资源保护与开发重点实验室,海南 万宁 570311)

从白木香树中分离了2株色二孢(Lasiodiplodiatheobromae)菌株B1和B2；人工接种试验证实它们能促进沉香的形成。本研究结果表明：色二孢菌株B1和B2菌丝生长的最适温度均为30 ℃；B1的最适培养基是PDA,B2的最适培养基是CA；B1、B2菌丝生长的最适pH值分别是7和8，最适碳源均为可溶性淀粉，最适氮源均为硝酸钠。

白木香;色二孢;结香;生物学特性

白木香Aquilariasinensis(Lour.) Gilg是国家二级重点保护野生植物,是珍贵国产药材沉香的唯一植物资源。沉香是树体受伤后分泌出来的油脂成分和木质成分的固态凝聚物,具行气止痛、温中止呕、纳气平喘之功效[1]。健康的白木香很难形成沉香,只有受到伤害(如物理、化学、微生物、虫等的伤害)后才能形成沉香。目前白木香的物理结香有打孔、获烙、砍伤等方法,但结香时间长,产量低。目前主要是以化学方法结香为主。真菌也被证实能引起白木香结香,如黄绿墨耳真菌[2]、镰刀菌(Fusariumsp.)[3-5]、蒂腐色二孢(Botryosphaeriarhodina)、红褐肉座菌(Hypocreajecorina)、里氏木霉(Trichodermareesei)、康氏木霉(Trichodermakoningii)[6]、拟盘多毛孢(Pestalotiopsisvirgatula)[7]、裂褶菌(Schizophyllumsp.)[8]、色二孢菌(Diplodiasp.)、可球二孢菌(Botryodiplodiantheobromae)等,但现今被真正用于结香的真菌还很少,可能是因为对这些真菌的生物学特性并未真正了解。为了更好地将真菌菌株应用于结香技术,有必要对它们的生物学特性进行研究。

1 材料与方法

1.1 供试材料

2株促进沉香形成的色二孢(Lasiodiplodiatheobromae)菌株B1和B2从白木香中分离纯化获得,保存于中国医学科学院药用植物研究所海南分所。

1.2 试验方法

1.2.1 不同培养基对色二孢菌丝生长的影响 选择马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、燕麦琼脂培养基(OA)、玉米粉琼脂培养基(CMA)、察氏琼脂培养基(Czapek)和胡萝卜琼脂培养基(CA)共5种培养基；接种直径为5 mm的色二孢菌块至含不同培养基的培养皿中心,在30 ℃恒温箱中培养,在培养24、36和48 h后采取十字交叉法测量菌落直径,每处理3次重复。

1.2.2 不同温度对色二孢菌丝生长的影响 取5 mm的菌块置于PDA平板中心,然后分别放在15、20、25、28、30、35、40 ℃下恒温培养。在培养24、36和48 h后采取十字交叉法测量菌落直径,每处理3次重复。

1.2.3 不同pH值对色二孢菌丝生长的影响 用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH调节PDA 培养基,分别制成pH值为5、6、7、8、9、10、11的PDA培养基,灭菌后再重新调整pH值。将5 mm菌块置于不同pH值的PDA平板中心上,在30 ℃恒温箱中培养,在培养24、36和48 h后采取十字交叉法测量菌落直径,每处理3次重复。

1.2.4 不同碳源对色二孢菌丝生长的影响 采用察氏培养基作为基础培养基,分别用甘露醇、D-山梨醇、乳糖、果糖、葡萄糖、可溶性淀粉、麦芽糖等不同的碳源等量代替基础培养基中的蔗糖，制成平板。将5 mm菌块置于平板中央,在30 ℃下培养24、36和48 h后采取十字交叉法测量菌落直径,每处理3次重复。

1.2.5 不同氮源对色二孢菌丝生长的影响 采用察氏培养基作为基础培养基,分别用牛肉浸膏、酵母浸膏、蛋白胨、硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵等不同的氮源等量代替基础培养基中的硝酸钠，制成平板。将5 mm菌块置于平板中央,在30 ℃下培养24、36和48 h后采取十字交叉法测量菌落直径,每处理3次重复。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对色二孢菌株B1和B2菌丝生长的影响

从图1可以看出：色二孢(L.theobromae)菌株B1在马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA上生长速度最快,2 d生长速度达114.75 mm；而在玉米粉琼脂培养基CMV上生长最慢。由图2可见：色二孢菌株B2在胡萝卜琼脂培养基CA上生长速度最快,2 d生长速度达44.00 mm；其次是PDA培养基,2 d生长速度为42.72 mm。 所以B1和B2最适的培养基分别是PDA和CA。

2.2 不同培养温度对色二孢菌株B1和B2菌丝生长的影响

从图3～图4可以看出：色二孢菌株B1和B2在15～35 ℃范围内均能生长,适宜温度范围为28～30 ℃,最适温度为30 ℃；而在40 ℃下菌丝基本上停止生长。

图1 B1菌丝在不同培养基上的生长结果

图2 B2菌丝在不同培养基上的生长结果

图3 B1菌丝在不同温度下的生长结果

图4 B2菌丝在不同温度下的生长结果

2.3 不同 pH值对色二孢菌株B1和B2菌丝生长的影响

色二孢菌株B1的菌丝在pH 5～11范围内均能生长,适宜的pH值范围为6～8,最适pH值为7(图5)。色二孢菌株B2菌丝生长的适宜pH值为 6～8,最适pH值为8(图6)。

图5 B1菌丝在不同pH值下的生长结果

图6 B2菌丝在不同pH值下的生长结果

2.4 不同碳源对色二孢菌株B1和B2菌丝生长的影响

由图7～图8可见：不同碳源对色二孢菌株B1菌丝生长的影响不大,适宜碳源为可溶性淀粉、葡萄糖和蔗糖，最适碳源是可溶性淀粉；B2菌丝生长的适宜碳源是可溶性淀粉和蔗糖，最适碳源是可溶性淀粉。

图7 B1菌丝在不同碳源培养基上的生长结果

2.5 不同氮源对色二孢菌株B1和B2菌丝生长的影响

由图9～图10可知，不同氮源对色二孢菌株B1和B2的菌丝生长均有一定的影响,最适氮源均为硝酸钠。

3 讨论

我们从白木香树分离了2株色二孢B1和B2,并证实它们能促进沉香的形成[9]。张争等[10]报道白木香枝枯菌的病原菌色二孢能促进沉香的形成；韩晓敏等[11]发现可可毛色二孢菌可以诱导白木香产生3种沉香倍半萜。据国内外文献记载,色二孢能为害农作物、林木、药用植物等,常引起桑树根腐病[12]、毛葡萄穗轴褐腐病[13]、沙田柚果腐病[14]、花生茎腐病[15]、葡萄溃疡病[16]、黑木耳“黑皮病”[17]、龙眼焦腐病[18]、高良姜叶枯病[19]、松枯梢病[20]、黄山栾树裂皮病[21]等病害,给生产带来很大的损失；但色二孢的生物学特性未见报道。

图8 B2菌丝在不同碳源培养基上的生长结果

图9 B1菌丝在不同氮源培养基上的生长结果

图10 B2菌丝在不同氮源培养基上的生长结果

本文对色二孢生物学特性的研究结果表明,色二孢菌株B1和B2在不同的培养基上都能生长,只是B1的最适培养基是PDA,B2的最适培养基是CA。色二孢B1和B2在温度15～35 ℃下都能生长,高于40 ℃不利于生长,但30 ℃是菌丝生长的最适温度，所以野外温度高于40 ℃不利于结香。色二孢B1和B2对营养成分和酸碱度的要求不是很高，均能生长,说明这2个菌株的生长能力很强。

本研究明确了色二孢2个菌株的生物学特性,可为优化菌株培养条件和利用真菌促进沉香的形成提供技术支撑。

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(责任编辑:黄荣华)

Study on Biological Characteristics of 2 Strains ofLasiodiplodiatheobromaePromoting Agarwood Formation

CHEN Xu-yu1,2, LIU Yang-yang1,2, LIU Pei-wei2, PENG De-gan2, WEI Jian-he1,2*

(1. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Chinese Peking Union Medical College, Beijing 100193, China; 2. Hainan Branch, Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Chinese Peking Union Medical College / Hainan Provincial Key Laboratory for Conservation and Development of Southern Medicine Resources, Wanning 570311, China)

Two strains (B1 and B2) ofLasiodiplodiatheobromaewere isolated fromAquilariasinensis. The artificial infection experiment proved that these two strains could promote the formation of agarwood. The results of this study on the biological characteristics ofL.theobromaeindicated that: the optimum temperature for the mycelial growth of both B1 and B2 was 30 ℃; the optimum culture medium for B1 and B2 was PDA and CA, respectively; the optimum pH-value for the mycelial growth of B1 and B2 was 7 and 8, separately; for both B1 and B2, the best carbon source was soluble starch, and the best nitrogen source was sodium nitrate.

Aquilariasinensis;Lasiodiplodiatheobromae; Agarwood formation; Biological characteristics

2016-10-11

国家自然科学基金项目(81303312);海南省应用技术研发及示范推广专项(ZDXM2015059);海南省重大科技计划项目 (ZDKJ2016004);中央级公益性科研院所基本科研业务费专项。

陈旭玉(1981─),女,海南临高人,副研究员,硕士,主要从事白木香微生物结香和南药植物保护研究。*通讯作者：魏建和。

Q939.99

A

1001-8581(2017)03-0095-04