噬菌体制剂的研究现状及其前景

裴宗飞

（山东省绿色食品发展中心 山东 济南 250022）

噬菌体制剂的研究现状及其前景

裴宗飞

（山东省绿色食品发展中心 山东 济南 250022）

噬菌体是一类病毒，因其感染原核生物，又叫做细菌病毒。早在1915年及1917年，英国著名的细菌学家Twort与法国的D’Herelle分别发现了噬菌体的存在。在噬菌体发现之初，科学家们便意识到其在细菌性疾病防制方面的应用价值，故做了大量试验研究其生物学特性。随着抗生素的出现，其研究被中断。当前耐药菌株不断出现及人们生物安全观念不断深化，噬菌体在细菌疾病方面的应用价值被重新重视起来，学者们又投入到对噬菌体的研究中，期望通过对其深入的研究，更好地应用于细菌疾病的治疗与预防。

噬菌体(Bacteriophage)是以细菌为宿主的一类病毒，所以又称为细菌病毒，它广泛存在于自然界中，在绝大多数原核生物中都发现了相应的噬菌体。据报道通过电镜观察到的噬菌体至少已有2850种(株)，其中有2700种(株)是有尾的，大肠杆菌噬菌体发现的最多，大肠杆菌也是研究得最深入的一种宿主。如A类中的T2、T4、T6，B类中的T1、T5、λ，C类中的T3、T7，D类中的ΥX174，E类中的F2、MS2，F类中的Fd、Fl、M13 等都属于大肠杆菌的噬菌体。噬菌体分为温和性噬菌体和烈性噬菌体，烈性噬菌体感染细胞后可立即在宿主细胞内开始自身的生命循环，引起细菌细胞的裂解。温和性噬菌体侵入宿主细胞后，其核酸附着并整合到宿主染色体上和宿主核酸同步复制。随宿主菌的增殖而增殖的噬菌体称为前噬菌体。如果宿主菌遇到某种不利环境条件，前噬菌体可能被激活进而裂解宿主细胞。从噬菌体制剂的角度考虑，温和噬菌体的实用价值不高，通常提到的噬菌体均为烈性噬菌体。

1 噬菌体制剂及其治疗特点

自从发现活噬菌体有治疗细菌感染的价值后，研究者已经建立了很多动物治疗模型以发掘其潜能。类似的报道有关于实验动物的，也有经济动物的，但总体数量较少，而且多用于研究常见细菌感染的治疗。出于安全性考虑，关于人的报道较少。在用分枝杆菌噬菌体TM4和D29治疗结核感染小鼠的试验中，分别得出了不同的研究结果，可能是由于研究者使用的试验材料和方法不同，因此对结核病的治疗效果还需进一步探索。猪沙门氏菌及大肠杆菌感染小鼠的试验证实，用噬菌体治疗具有明显的效果。在人MRSA感染的临床试验中，噬菌体也被证明有可靠的疗效。

1.1 裂解酶的治疗 裂解酶(lysin或endolysin)是双链DNA噬菌体在自身复制晚期合成的一类细胞壁水解酶，又称内溶素或溶胞壁酶。因为裂解酶能作用于细菌细胞壁的肽聚糖，破坏细菌保护层，所以可作为起杀菌作用的治疗药物。该酶对革兰氏阳性菌作用较强，已经作为一种新型杀菌制剂被广泛应用于治疗化脓性链球菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌等引起的感染性疾病。裂解酶制剂与抗生素相比，所用剂量小、特异性强。有试验将化脓性链球菌长时间暴露于含低浓度裂解酶的平板上，连续传代40次仍不产生耐药性，但如果使两者长时间接触后是否会产生耐受性，还无试验证明。与噬菌体相比，裂解酶的裂解谱更广，机体对裂解酶产生的抗体不会削弱其杀菌作用。使用单一性质的裂解酶会限制其应用范围，所以具有多种性质的嵌合性裂解酶将会是未来研究的热点。

1.2 治疗载体 有些噬菌体能表现出溶源化等现象，因此可被用于运载抗癌药物、非特效药、杀菌剂或者编码致死性杀菌蛋白的基因到相应的病原体侵染部位，直接与病原体结合或将其承载的物质注入病原体感染细胞内。在这些人为构造的载体系统中，噬菌体虽没有真正起到治疗作用，却解决了难以使药物直接在体内接触目标的难题。利用噬菌体裂解酶能够使对应的宿主菌变成一个空壳)))菌影，该物质因保留了一套完整的抗原而可作为口服疫苗开发的对象，又因无致病性而可作为药物、酶等的载体。

1.3 噬菌体治疗的特点 虽然早期噬菌体制剂的治疗效果不理想，但不能因此否认噬菌体在临床应用中的价值，噬菌体治疗有许多潜在的优势。（1）从噬菌体的特性来看，噬菌体可以随宿主菌的增殖而增殖，并在细菌感染的整个过程中发挥作用，而不像抗生素那样随着时间的推移疗效逐渐降低。（2）在解决耐药性问题上，噬菌体具有高度的宿主特异性，可以杀灭特定的菌型，并可以减轻由于用药所带来的体内菌群失调，同时减少由之所带来的耐药性问题，其原因是噬菌体能靶向到达细菌表面受体，从而弱化耐药突变。另外噬菌体可以单独使用，也可以与其它抗生素联合使用以减少耐药性问题。（3）从应用方面来看，噬菌体的副作用很小。对于那些对抗生素敏感的人来说，噬菌体制剂更是一种理想的治疗途径。准确选择相应的噬菌体也可作为预防用制剂。而且噬菌体制剂获取比较方便，价格比较低廉。

2 噬菌体制剂作用机理

噬菌体制剂作用于细菌有两种方式：（1）第一种方式为裂解途径，烈性噬菌体(Virulentphage)感染敏感细菌后，可在其细胞内快速增殖并使之裂解。裂解是一个高度调节的程序化过程，其经典模式是孔蛋白—内溶素途径。孔蛋白控制内溶素的含量，而内溶素的多少决定了裂解的时间。噬菌体进入细菌体内后利用细菌体内的酶系统，进行其自身生物物质的合成。然后子噬菌体以裂解方式从细菌体内涌出，造成细菌的死亡。例如T系噬菌体侵入大肠杆菌(B系)的过程约需30 min便能引起被侵入菌的裂解。（2）第二种方式是通过噬菌体的分泌物—内溶素而起作用的，内溶素是噬菌体进入宿主菌后利用细菌体内的物质合成的一类酶蛋白。根据宿主菌的不同可分为两类:革兰氏阳性菌内溶素和革兰氏阴性菌内溶素。革兰氏阴性菌有三种不同原型的内溶T4gpe、λR和T7，这三种内溶素都是可溶性的且小于20Kda的球蛋白；革兰氏阳性菌的内溶素结构复杂且分子量大于或等于30Kda，C末端有一个直接与细胞壁结合的结构域，能够高度特异性的识别细菌细胞壁决定簇。结合区域可以帮助酶在厚厚的细胞壁中保持活性，并且一旦孔蛋白引发了裂解反应，将更加迅速和彻底的破坏细胞壁。这些结合区域的存在以及高度的专一性，使噬菌体可以作为一种新型的抗菌制剂使用。而革兰氏阴性菌的内溶素则缺乏这些区域。通过生物工程技术分离提纯内溶素，用于临床感染治疗。既可以保证治疗的高效性，又具有较高的安全性。例如，噬菌体C1的内溶素粗制品，纳克级就可以在5s内杀死107个肺炎链球菌。同样数量的内溶素可以有效预防和治疗小鼠口腔中的链球菌。如果使用不同的酶不同的方式攻击胞壁质，内溶素对链球菌的致死性表现出协同效应。因此，在生产中我们可以利用各种酶蛋白不同的组合，扩大宿主谱有效治疗生产中存在的多重感染。

3 噬菌体制剂的应用

细菌性疾病一直困扰着养殖业的发展，每年此防和治疗这些疾病，花费了大量的资金。治疗细菌病的常用方法是使用各种抗生素，但随着大量耐药菌的出现，抗生素对各种细菌的抑菌效果已达不到预期的要求。而且随着多种新型抗生素的出现，细菌的耐药谱也在不断扩展，因此急需研制新型抗菌制剂来解决耐药性问题。噬菌体作为一种新兴的治疗方法，已经越来越受到医疗机构的关注，美国医疗机构在1999年的国际噬菌体会议上预测，在未来的3～5年内，美国医院将使用噬菌体制剂治疗抗生素无法控制的感染。

4 噬菌体在水产养殖中的应用现状

（1）在水产养殖中治疗细菌性疾病的常用方法是使用各种抗生素，但随着大量耐药菌的出现，抗生素对各种细菌的抑菌效果已达不到预期的要求1而且随着多种新型抗生素的出现，细菌的耐药谱也在不断扩展，因此急需研制新型抗菌制剂来解决耐药性问题1噬菌体作为一种新兴的治疗方法，已经越来越受到医疗机构的关注。（2）近年来，人们对海洋环境中噬菌体的研究兴趣日益增长。随着技术的发展，海洋环境中噬菌体的存在及其重要作用得到了认可一电子显微镜研究结果表明，海水中噬菌体的数量可达104～107pfu/ml海洋中的细菌，蓝细菌及真核微生物都发现有它们的噬菌体存在；它们对海洋环境中的细菌的群落、类型和数量等的变化产生重要的影响。此外，噬菌体作为指示微生物，在监测海洋环境，指示污染程度等方面的研究也有了一些进展活。

5 噬菌体研究中存在的问题

5.1 菌体的宿主范围窄 噬菌体具有高度的特异性，所以治疗性噬菌体往往只对某一型或几型的细菌有效，而对其他菌株裂解效果很弱或无治疗作用，使其应用的范围受到很大的限制

5.2 噬菌体的制备要求高 早期的噬菌体是由宿主菌的粗裂解物中分离的，其中混有很多杂质，包括细菌内毒素，这些杂质对噬菌体的治疗效果产生负面影响

5.3 噬菌体的稳定性差 在早期的噬菌体制剂中常需加入汞制剂或氧化剂以确保无菌但经过处理以后，噬菌体的活性有不同程度的降低，治疗效果也受影响

5.4 噬菌体作用方式缺乏了解 许多研究者因为无法区分温和性噬菌体和毒性噬菌体，而错用温和性的作为治疗之用，导致治疗效果很差甚至无效

5.5 噬菌体制剂使用条件要求过高 有一种名为Enterophagos噬菌体制剂，只对湿疹荨麻疹和疱疹有效，若条件不符时几乎无效解决问题的方法：（1）优选菌株，并选用高裂解性、高特异性的噬菌体用以克服噬菌体裂解谱窄的问题。（2）通过纯化噬菌体制剂来降低毒素水平。（3）为减少机体免疫系统对噬菌体的吞噬，延长噬菌体在体内发挥作用的时间，可采用连续传代并选择发生突变后能在循环系统内存活的噬菌体用于治疗。

6 展望

随着对噬菌体生物学特性研究的不断深入和拓宽，单一运用噬菌体治疗疾病存在的不足势必会被解决。在当前科学领域多学科综合的大趋势下，基于噬菌体的多学科综合开发新技术或设备也一定会引起科学工作者的广泛关注，如与生物芯片联合应用的技术将会日渐成熟。噬菌体诸多性质将使其在医学领域发挥重要作用。在未来几年里，将会有越来越多的噬菌体新药上市。然而根据进化理论，不管是哪种药物，病原菌总会对其产生耐药性，而这种耐药性的出现与密度感应现象有很大的关系，故而开发阻止细菌间信息传递的药物以抑制耐药菌株产生也会成为新药研究的热点。

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