副猪嗜血杆菌实验室诊断方法研究进展

马树芳 赵小勇 程志伟

（山东省滨州市滨城区北镇兽医站 256600）

副猪嗜血杆菌实验室诊断方法研究进展

马树芳 赵小勇 程志伟

（山东省滨州市滨城区北镇兽医站 256600）

副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌引起的猪的呼吸道传染病，主要感染断奶前后仔猪，引起猪多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎，已严重影响养猪业的发展，因此早期诊断有助于防控该病。本文对副猪嗜血杆菌病实验室诊断方法及其研究现状进行了综述。

副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)引起猪的以纤维素性浆膜炎、多发性关节炎和脑膜炎为特征的传染病。该病在全世界均有发生，通常见于5-8周龄的猪，发病率一般在10%-15%，严重时死亡率可达50%。随着规模化养猪业的发展，副猪嗜血杆菌的发病率呈现递增趋势，给养猪业带来了较大的经济损失。因此，有必要对副猪嗜血杆菌病的诊断方法做全面的了解。及时、准确地诊断出该病并采取相应的措施是成功防制副猪嗜血杆菌病的关键。临床上可根据该病的流行特点、临床特征和病理剖检变化做出初步诊断，但确诊需要进行实验室检验。目前，常用的实验室诊断方法包括细菌分离与鉴定、血清学方法和分子生物学方法等。

1 细菌分离与鉴定

（1）细菌的分离鉴定对副猪嗜血杆菌病的确诊很有必要，也是当前最准确有效的诊断方法。但该菌的分离是很困难的，对病料、采集时间、培养基都有很高要求。一般应选取临床症状典型且最好未经抗生素治疗的病猪，采取人工致死的方法，从全身各个部位采取新鲜病料，且从采集病料到送检一般不超过24h。同时应注意的是，仅从鼻腔、扁桃体或气管等组织脏器中分离细菌，对于评估是否由HPS引起的致病是没有意义的，应从全身多个部位如心包、关节、心血、脑脊液等处进行病原分离。（2）副猪嗜血杆菌对生长环境的要求极为苛刻，且生长依赖外源NAD(V-因子)(Kielstein等，2001)。现在常用马、绵羊或者牛的鲜血做成巧克力培养基，但菌落仍然生长很差，形成大约0.5mm的灰白色透明的菌落。但在含有V因子的TSA或者TM/SN上生长较好。葡萄球菌可产生V因子，需V因子的副猪嗜血杆菌可在其周围生长呈“卫星现象”。本菌可分解蔗糖和尿素，不分解乳糖、甘露醇和麦芽糖，对葡萄糖发酵不稳定；醋酸铅试验呈阴性，硝酸盐还原试验呈阳性。

2 血清学方法

（1）临床上用于检测HPS抗体的方法有补体结合试验(CF)、间接血凝试验(IHA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。CF和IHA存在检测特异性不强，敏感性较低、稳定性较差。ELISA方法检测HPS较为敏感和特异，因而在HPS的临床检测上优于前者。（2）王艳等(2006)选用全菌作为包被抗原建立HPS抗体间接ELISA方法，具有较好的试验效果。石碧等(2007)提取HPS细菌的荚膜多糖(CPS)，并以其为抗原分别建立了间接ELISA和间接血凝试验(IHA)两种抗体诊断技术，两种检测方法均有很好的特异性，但ELISA是IHA检测方法敏感性的5-10倍。冯小明等(2009)将HPS菌体超声裂解，取上清作ELISA包被抗原，建立了HPS抗体间接ELISA方法。贾爱卿等(2011)将HPS外膜蛋白omp P2基因插入表达载体pET-32a，转化BL21进行诱导表达，以纯化的omp P2蛋白作抗原，建立了间接ELISA方法。李鹏等(2011)将HPSP2蛋白基因亚克隆到原核表达载体pET-32a构建重组表达质粒pET-P2，在IPTG的诱导下成功表达了可溶性融合蛋白P2-His；利用纯化融合蛋白为抗原，建立了抗HpsP2蛋白抗体的间接ELISA方法。李淼等(2011)将重组表达的omp P2纯化后作为抗原，建立了HPS间接ELISA方法。郑念广等(2011)高温高压处理HPS 4型和5型耐热蛋白混合作为包被抗原，建立了检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法，该方法特异性和重复性良好，检测结果与国外试剂盒一致。陈善真等(2011)利用表达纯化的HPS外膜蛋白也建立了间接方法，应用结果与HPS临床分离率接近。

3 分子生物学方法

临床病原分离的诸多不确定性需要一种新的技术来代替，而分子生物学技术的引入就是一个突破，其中PCR技术具有灵敏度高、特异性强、快速、简便等优点，同时克服了培养困难、血清学检测易发生交叉反应的缺点，在诊断HPS病时具有明显的优势，并得到了广泛的应用。

3.1 普通PCR法 （1）Oliveira等(2001)建立一种PCR方法最低检测量为102CFU/mL，其敏感性远远高于常规的细菌分离法，24h内可报告检测结果，并具有高度特异性。以从猪器官中经常分离到的15种细菌和A.nidohucs抽提的DNA为模板利用该方法进行检测，前者全为阴性后者观察到一个弱的条带。由于A.nidolcius主要存在于正常猪的上呼吸道，因此该法可以全身系统收集的样本作为模板，用于发病猪场全身感染情况的确定。del Rio等(2003)以PCR-RFLP法对15种副猪嗜血杆菌标准菌株和101株副猪嗜血杆菌临床分离株的tbpA基因进行分析，结果前者产生12种不同的图谱，血清型5、12、14和15具有共同的酶切图谱;后者表现出33种RFLP图谱，其中有10株细菌与标准菌株产生的图谱一致。林雪玲等(2006)在细菌学鉴定基础上，设计合成3对引物，分别以分离菌株的DNA为模板进行PCR扩增，结果均扩增出副猪嗜血杆菌的822bp、824bp和1.9kb的预期特异性条带。该方法特异性与敏感性高、适用性强，不仅可从初代分离培养物中对HPS进行鉴定和感染确诊，而且可以直接对病料进行HPSPCR检测。李鹏等(2010)设计了能扩增HPS OMP P2基因的1080bp片段的引物，并证明用该法可有效地鉴定或诊断HPS，这种PCR的敏感性达到了1000个HPS。刘建奎等(2012)针对HPS 16S rRNA序列设计1对特异性引物，建立了快速准确鉴定HPS的PCR方法，临床试验证明该方法具有很好的特异性和敏感性。（2）周勇岐等(2007)以HPS的16SrRNA基因为模板设计合成引物，建立了HPS-PCR检测方法。利用该方法可以有效区分胸膜肺炎放线杆菌、副鸡嗜血杆菌等与HPS同源性较高的细菌。尹秀凤等(2007)用建立的猪嗜血杆菌PCR方法检测人工感染发病仔猪及自然感染仔猪肺组织，并结合细菌分离培养，证明以肺脏组织为病料，通过细菌分离培养，再用PCR法鉴定分离菌体，可有效地用于HPS的诊断。米丰泉等(2005)在已经建立的猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)、猪多杀性巴氏杆菌(PM)、副猪嗜血杆菌的单项PCR诊断方法的基础上，通过对扩增条件的筛选，成功地建立了APP、PM、HPS复合PCR诊断方法，并应用临床诊断。利用一次PCR反应，即可同时扩增APP的342bp、PM的457bp和HPS的821bp的特异性片段，该方法的建立对临床上进行这3种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测都具有重要意义。张盼锋等(2009)针对HPS 16S rRNA基因特异性PCR引物序列，合成1对PCR引物，建立相应的PCR检测方法。结果显示可检测出浓度为2.8×103CFU/mL的HPS，表明该方法灵敏度高；对大肠杆菌、链球菌、巴氏杆菌、沙门氏杆菌、金黄色葡萄球菌进行PCR扩增均不获得任何条带，表明该方法特异性较强。所以该方法对于临床快速检测Hps具有重要意义。万世平等(2009)设计了1对针对HPS 16S rRNA基因的引物，建立了能特异性检测Hps的PCR检测方法。对传染性胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌、大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌等均无交叉反应，扩增的目的条带的大小为821bp。

3.2 实时荧光定量PCR方法 （1）实时荧光定量PCR法是将光谱技术和 PCR技术相结合的一种核酸定量检测技术，与常规PCR方法比有很多优点，如反应时间短，扩增产物不需用琼脂糖凝胶电泳检测，全封闭反应，更高的检测特异性与敏感性。（2）于江等(2010)建立了HPS SYBR Green I荧光定量PCR检测方法，建立的检测方法不与其它猪源性病原菌发生交叉反应，有很好的特异性，敏感性是常规PCR的100倍，批内、批间重复试验变异系数均不大于2.5%，稳定性好。李军等(2011)建立了快速定量检测HPS的实时荧光定量PCR方法，其变异系数均小于2%，检测的最低限度是50copies/μl。苗立中等(2012)建立了HPS SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。建立了标准曲线，线性关系在102～108copies/μL非常好；敏感性为10copies/μL，是常规PCR的100倍；变异系数均不大于2.5%，并且对HPS检测的特异性很好。李富祥等(2013)根据HPS 16S rRNA基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针，建立了HPS TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。该方法与巴氏杆菌、沙门氏菌、乳杆菌链球菌、肠球菌、葡萄球菌、猪肺炎支原体等很多细菌无交叉反应；标准品浓度在6.92×108-6.92×103copies/μl范围内具有良好的线性关系，最低可检测到6.92×101copies/μl的标准品阳性质粒；批内和批间变异系数均小于3%。临床样品检测结果表明，该方法具有敏感性高、特异性好、稳定性强和快速的优点，可用于HPS感染的早期诊断和流行病学调查以及HPS的定量分析。

3.3 环介导等温扩增检测技术 （1）环介导等温扩增(LAMP)技术是一种核酸等温扩增技术，具有操作简单、成本低、检测效率高等特点，非常适合在现场和基层部门应用。但是，实际操作中，由于其灵敏度高，一旦开盖容易形成气溶胶污染，结果出现假阳性，采用实时浑浊仪可以有效避免这个问题，另外LAMP对引物设计要求高，因此对HPS的引物仍需进行进一步改善，确保结果稳定性。（2）吴诗敏等(2010)根据HPS 16S rRNA基因设计引物，使用Bst大片段聚合酶，以提取的细菌基因组DNA为模板进行等温扩增。结果表明，建立的方法能在65min完成检测全过程，检测到HPS DNA的最小量为0.2pg，是常规PCR的1000倍。朱杰仪等(2010)建立的HPS环介导等温扩增方法在恒温(63℃)条件下特异性强，灵敏度高，最低检测量达到0.3pg DNA，检测敏感性是常规PCR的100倍。车勇良等(2013)建立了HPS可视化LAMP检测方法，在55℃水浴1h即可对HPS基因组DNA进行扩增，在反应后的体系中加入SYBR Green I，即可对结果直接观察做出判断。该方法具有很强的特异性，其对DNA核酸的最低检测限为40fg，是常规PCR检测最低限的100倍，显示出较高的敏感性。用建立的LAMP方法对8株不同血清型HPS进行检测，结果均为阳性。

4 小结

伴随我国养猪业的快速发展，该病的流行越来越广泛，已经成为呼吸道疾病综合症中的重要疾病，对猪的危害日趋严重，对养猪业造成了巨大的经济损失。因此，快速、准确地诊断出该病并采取相应的措施是成功防治该病的关键，还能及早发现新菌株，鉴别最危险的病原菌并开发相关疫苗，在防控疫情时掌握主动权。随着各种灵敏度高、专属性强的实验室检测方法的不断改进，对于该病的诊断已更加客观和迅速，尤其是对疫苗免疫后抗体水平的检测及HPS的流行病学调查更加重要，对于指导副猪嗜血杆菌病的防控具有重要意义。

[1] del Rio ML, Gutierrez CB, Rodriguez FEF. Value of indirect hemagglutination and coagglutination tests for serotyping Haemophilus parasuis[J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(2): 880-888.

[2] Kielstein P, Wuthe H, Angen O, et al. Phenotypic and genetic characterization of NAD-dependent Pasteurel laceae from the respiratory tract of pigs and theirpossible pathogenetic importance[J]. Vet Microbiol, 2001, 81: 243-255.

[3] Oliveira S, Galina L, Pijoan C. Development of a PCR test to diagnose Haemophilus parasuis infections[ J]. J Vet Diagn Invest, 2001, 13(6): 495-501.

[4] 车勇良, 陈如敬, 王隆柏等. 副猪嗜血杆菌可视化LAMP检测方法的建立与应用[J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版), 2013, 41(12): 61-66.

[5] 陈善真, 李春玲, 贾爱卿等. 副猪嗜血杆菌OMP5基因的克隆、表达及间接ELISA检测方法的建立[J]. 中国农业科学, 2011, 44(14): 3036-3044.

[6] 冯小明, 储岳峰, 贺英等. 副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立与应用[J]. 中国兽医科学, 2009, 39(7): 597-601.

[7] 李富祥, 熊和丽, 姚俊等. 副猪嗜血杆菌TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用[J]. 中国兽医科学, 2013, 43(12): 1268-1273.

[8] 李军, 谢宇舟, 禤雄标. 副猪嗜血杆菌实时荧光PCR快速检测方法的建立和应用[J]. 安徽农业科学, 2011, 39(6): 3607-3609.

[9] 李淼, 李春玲, 叶严锋等. 基于重组外膜蛋白P2的副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA方法的建立[J]. 华北农学报, 2011, 26(4): 61-66.

[10] 李鹏, 姜平, 李军星等. 副猪嗜血杆菌重组 P2 蛋白的高效表达及间接ELISA方法的建立[J]. 中国兽医学报, 2011, 31(4): 480-484.

[11] 李鹏, 李军星, 李玉峰等. 副猪嗜血杆菌OMP P2基因PCR检测方法的建立与应用[J]. 中国兽医学报, 2010, 30(10): 1321-1325.

[12] 林雪玲, 黄耿森, 冼琼珍等. 副猪嗜血杆菌分离鉴定与PCR检测方法的建立及应用[J]. 吉林农业大学学报, 2006, 28(3): 321-323.

[13] 米丰泉, 陈小玲, 王翠敏等. 猪的胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌复合PCR检测方法的建立[J]. 动物医学进展, 2005, 26(5): 85-88.

[14] 苗立中, 沈志强, 韩文瑜等. 副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 动物医学进展, 2012, 33(11): 85-89.

[15] 石碧, 崔耀文, 贾凡等. 副猪嗜血杆菌血清5型间接血凝试验和间接 ELISA 抗体检测方法的建立[J]. 中国兽医科学, 2007, 37(11): 964-968.

[16] 万世平, 王建, 葛菲菲等. 副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立与初步应用[J]. 动物医学进展, 2009, 30(1): 9-12.

[17] 王艳, 夏万田, 姜平等. 副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测方法的建立[J]. 畜牧与兽医,2006, 38(3): 5-6.

[18] 吴诗敏, 陈芳艳, 陈瑞爱等. 副猪嗜血杆菌环介导等温扩增快速检测方法的建立[J]. 畜牧与兽医, 2010, 42(4): 28-32.

[19] 尹秀凤, 王艳, 姜平等. 猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立与应用[J]. 中国兽医学报, 2007, 27(2): 180-183.

[20] 于江, 吴家强, 张玉玉等. 副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测技术的建立与应用[J]. 家畜生态学报, 2010, 31(4): 77-81.

[21] 张盼锋, 仇微, 刘宇等. 副猪嗜血杆菌PCR快速诊断方法的建立[J]. 广东畜牧兽医科技, 2009, 34(1): 33-36.

[22] 郑念广, 谭实勇, 何玲等. 副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立与应用[J]. 中国畜牧兽医, 2011, 38(8): 185-188.

[23] 周勇岐, 刘茂军, 苏国东等. 副猪嗜血杆菌PCR鉴定方法的建立[J]. 猪业科学, 2007, 12: 26-27.

[24] 朱杰仪, 谭实勇, 曾小娜等. 副猪嗜血杆菌环介导等温扩增检测方法的建立[J]. 中国畜牧兽医, 2010, 37(2): 204-207.

S852.61+2

A

1007-1733(2017)05-0060-03

2017–01–13）