副猪嗜血杆菌潜在毒力因子研究进展

赵小勇 马树芳 程志伟

（山东省滨州市滨城区北镇兽医站 256600）

副猪嗜血杆菌潜在毒力因子研究进展

赵小勇 马树芳 程志伟

（山东省滨州市滨城区北镇兽医站 256600）

副猪嗜血杆菌是引起猪格氏病的病原，多继发感染引起全身性疾病，其高发病率和死亡率给养殖业造成严重损失。本文主要对副猪嗜血杆菌的外膜蛋白、荚膜多糖、、菌毛、转铁结合蛋白、酶类和毒素等主要毒力因子的相关研究进展进行了综述。

副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis，Hps)是常规猪群上呼吸道的一种条件性致病菌，在某些因素的条件下，可突破黏膜屏障，从而引起严重的全身性感染，以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要特征，该菌引起的革拉氏病流行和危害日渐严重，严重危害仔猪和青年猪的健康(薛国聪和任涛，2009)。随着养猪集约化程度的提高以及饲养条件和饲养管理的改变，副猪嗜血杆菌病的发生呈逐年上升的趋势，已成为危害养猪业的一种严重的细菌性传染病(张焕容，2010)。由于Hps菌株间存在抗原异质性和毒力的差异(Kielstein和RappGabrielson，1992)，因此，辨别常在菌和毒力菌株是控制和诊断副猪嗜血杆菌病的关键，Hps毒力因子的鉴定将为新型疫苗的设计奠定基础。

1 外膜蛋白(OMP)

（1）Hps的外膜蛋白(OMP)是其重要的毒力因子之一。Ruiz等(2001)研究表明，外膜蛋白与Hps的毒力有关，健康仔猪与患病猪分离的HpsOMP不同，有多发性浆膜炎和关节炎症状的猪分离的OMP基本相同。OMP蛋白共有8种，大小分别约为92、88、53、60、46、37、31、15ku。Hps强毒株都具有一类分子质量在37ku左右的蛋白质。应用SDS-PAGE技术发现，副猪嗜血杆菌的OMP具有2个完全不同的生物型：即生物1型和生物2型。由健康猪鼻黏膜分离到的菌株表达的是生物1型OMP，包括两个蛋白，其分子量一为约68ku；另一蛋白的分子量在23～40ku之间。由副猪嗜血杆菌病病猪分离到的菌株通常含生物2型OMP，其以约37ku的优势蛋白为特征。在副猪嗜血杆菌中发现了两个与流感嗜血杆菌具有同源性的外膜蛋白P2和P5，该蛋白与细菌黏附有关，在毒力株和非毒力株中P2蛋白的大小有所不同，在毒力株中为48ku，而在非毒力株中却为55ku，可通过P2蛋白来区分毒力株和非毒力株(Olver等，2010)。（2）通过2D电泳和MALDI-TOFMS和免疫印迹分析发现HpsOMP家族中6个具有强免疫原性的蛋白质，分别是FhuA、OmpA、PalA、OmpP2、D15和HPS-06257，另外Plp4、Wza和Omp5这3个蛋白质因其在相近菌属的重要性而同样不能忽视(Zhou等，2009)其中，OmpP2是一种孔蛋白，在Hps外膜中含量最多，且存在2种蛋白结构，并被证明是Hps保护性抗体的靶蛋白，在小鼠攻毒试验中起部分保护作用，是潜在抗原和毒力因子(Mullins等，2009；)。对HpsSC096株△OmpP2缺失突变株和其互补菌株的研究显示，OmpP2缺失导致Hps对猪肺泡巨噬细胞(3D4/2)黏附能力降低和细胞外存活细菌数的减少，可推知OmpP2参与细菌抗吞噬作用，同时缺失株表现生长缓慢，而且在正常猪和兔血清中存活率极低，而互补菌株却恢复了对血清补体的正常抵抗能力，说明OmpP2与细菌抗补体介导的血清杀菌作用有关(Zhang等，2012)

2 菌毛

（1）HpsSH0165具有4个IV型菌毛基因，编码主要结构单元PilA(HAPS2013)和3个生物合成蛋白PilB、PilC和PilD(Xu等，2011)。血清4型副猪嗜血杆菌gx033基因组信息显示其存在pilF基因，该基因编码一个菌毛生物合成和穿梭运动蛋白(Li等，2013)。（2）Munch等(1992)研究发现，副猪嗜血杆菌在体内传代后能够生成菌毛样结构，且可从没有任何临床症状的猪鼻腔内分离到Hps，但其致病作用不清楚。Vahle等(1997)研究表明，从鼻腔中分离的副猪嗜血杆菌与急性化脓性鼻炎、鼻腔和气管黏膜的急性细胞肿胀及纤毛丢失有关，并推断黏膜的这些变化可能使副猪嗜血杆菌侵入机体并进入血流，且透射电子显微镜和免疫组织化学的结果均显示纤毛丢失和细胞变性的部位有副猪嗜血杆菌。Hps血清5型Nagasaki株(从患脑膜炎的病猪中分离)能够以非常高的水平粘附并侵入猪脑微血管内皮细胞(PBMEC)，电镜照片也证实了这种能力。比较从脑膜炎或肺炎病猪中分离的不同血清型HPS对PBMEC的粘附和侵袭水平，发现血清4型和5型比其他血清型具有更高的粘附能力。抑制试验结果表明，Hps侵袭PBMEC需要肌动蛋白微丝和微管骨架重排，蛋白侵袭素在Hps进入PBMEC的过程中似乎并没有起到主要作用。侵袭血脑屏障的内皮细胞可能是Hps引起脑膜炎的原因(Anna等，2006)。

3 荚膜多糖(CPS)

Perry等(2013)检测了5型和15型副猪嗜血杆菌的荚膜组成，荚膜结构是由一个二糖重复单元β-六磷酸葡萄糖主链和2,4-氨基-2,4,6-三羟基-D-吡咯半乳糖侧链组成，侧链在血清15型菌株中被α-Neu5R-3-α-GalNAc-1-P取代，血清5型菌株被α-Neu5R-3-α-Gal-1-P取代，其中R是指N-乙酰基或N-羟基。荚膜多糖抗原的成分主要是多糖和磷壁酸，具有型特异性，与细菌毒力有关。Morozulni和Nieolet(1986)报道了自健康猪上呼吸道上分离的大多数副猪嗜血杆菌具有荚膜，而从其他部位分离的菌株多数没有荚膜。通过活体内传代的方法可筛选出产生荚膜的副猪嗜血杆菌，而在培养基上经多次传代后发现有荚膜的细菌数量已然减少(Rapp-Gabrielson和Gabrielson，1992)。荚膜、菌毛、外膜蛋白与巴氏杆菌科的多个成员在上呼吸道定居有关。但是目前Hps的荚膜多糖、全细胞蛋白图谱及毒力之间的关系尚有争议。

4 转铁结合蛋白(TBP)

（1）从胞外获取和摄入铁元素是真核生物生长必不可少的，也是病原菌感染中存活必要条件，细菌进化产生了一些高特异性蛋白在缺铁环境中捕获铁元素。副猪嗜血杆菌含有的转铁结合蛋白可为细菌生长提供必需的铁离子，转铁结合蛋白在副猪嗜血杆菌对宿主动物的感染中发挥了决定性的作用。转铁结合蛋白能够特异地捕获宿主的铁离子，并将其转运到细菌的细胞浆中，以供细菌生长。转铁结合蛋白是位于菌体外膜上特异性结合转铁蛋白的受体，它由2种不同的蛋白组成，即转铁结合蛋白A(tbPA)和转铁结合蛋白B(tbPB)，其中tbPA可能是一种穿膜蛋白，而tbPB的N端脂肪酸残基镶嵌在外膜上，通过两者的共同作用特异性的从宿主动物体内捕获转铁蛋白来获取铁离子，以满足细菌的生长需要。在tbPB基因的上游还有2个共转录基因exbB和exbD，其表达产物ExbB和ExbD有助于铁的获取(Charfand等，1995)。（2）Martinez等(2010)克隆表达出由200个氨基酸组成的Hps5型重组TbpA蛋白，纯化后制备多抗，免疫印迹法证明在缺铁环境下培养的Hps、胸膜肺炎放线杆菌(A.pleuropneumoniae)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)提取物中有TbpA蛋白；ELISA结果表明，其对其他巴斯德菌科细菌的TbpA蛋白也反应，说明该重组蛋白可能具有一段免疫显性区；血清杀菌活性试验结果表明，其会引起补体介导的血清杀菌作用；而且通过免疫金标记技术证明了细菌表面的TbpA能够结合特异性多抗，由此推测TbpA是一种疫苗备选抗原。delRío等(2005)对包含ExbB、TbpB、TbpA蛋白的TonB区域进行扩增后发现TbpB在Hps不同血清型之间具有较大差异，而且在铁缺乏的条件下，ExbB、TbpB、TbpA蛋白表达量有所增多，对Hps重组TbpB蛋白的研究表明，其可能与脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)的TbpB蛋白相同都具有免疫原性。（3）细菌fur基因和铁吸收相关，Bigas等(2006)通过自然转化法将携带有fur基因的自杀载体导入Hps中，通过同源重组构建fur基因缺失突变株，结果发现缺失fur基因后菌体不能存活。

5 酶类

（1）神经氨酸酶在Hps菌的对数生长期末期开始表达，其作用是通过与透酶和醛缩酶协同作用，通过夺取宿主细胞的碳水化合物而增强细菌毒力。除了对营养方面的影响以外，神经氨酸苷酶能够介导清除与宿主细胞糖原结合的唾液酸，从而暴露出细菌定居或侵入宿主细胞所需的受体，并通过降低黏蛋白的黏性从而干扰宿主的防御系统。Carol等(2003)从Hps的细胞膜上抽提纯化了神经氨酸酶，其分子质量约为82ku；与哺乳动物的大多膜结合神经氨酸酶相反，该酶抽提后很稳定，证明该酶为一个有潜在毒力的因子，从而进一步推动了Hps致病因子的研究。刘俊琦等(2010)研究了HPS的神经氨酸酶基因作为候选基因疫苗的免疫原性，攻毒试验结果显示：氢氧化铝佐剂组的保护性较低，仅有10%，而弗氏佐剂组具有较高的保护性，保护率高达60%。（2）6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-DPG)催化葡萄糖-6-磷酸和水合成6-磷酸葡萄糖酸内酯，是磷酸戊糖途径的限速酶，同时还可以维持细胞内NADPH含量，这对血管内皮因子的生成等细胞功能至关重要。Fu等(2012)克隆表达Hps5型中6-DPG，通过Westernblotting方法证明6-DPG蛋白存在于细胞膜上，并发现其可以使Hps对猪肺泡上皮细胞(SJPLC)黏附率降低到69.5%，重组6-DPG蛋白可以诱导SJPLC产生炎症刺激因子IL-6和IL-8，但与活菌和热灭活菌相比要弱得多。对6周龄BALB/C小鼠免疫用重组6-DPG蛋白和弗氏完全佐剂制成的疫苗，2周后加强免疫1次，再腹腔注射5倍LD50(5.7×108)剂量的Hps攻毒，与阴性对照相比其保护率可达到75%。由此可知6-DPG也可以作为Hps抗菌剂或疫苗的备选抗原。

6 毒素

（1）毒素包括内毒素和外毒素，也是细菌毒力的重要组成部分。Amano(1997)等曾对脂多糖的致病作用进行了研究，利用血清5型菌株接种动物后发现，血液中LPS抗体的出现与血栓形成、弥漫性血管内凝血有关。业已清楚，副猪嗜血杆菌的脂多糖具有与其他革兰氏阴性细菌内毒素相似的活性。因此，脂多糖也可能是副猪嗜血杆菌的一个重要的毒力因子。但是Zucker等(1996)并未发现副猪嗜血杆菌强毒株的脂多糖与无毒株的脂多糖有何明显差异。同样，Miniats等(1991)发现，用含有脂多糖和外膜蛋白抗原的细菌免疫动物，有外膜蛋白抗体的猪能抵抗强毒菌的攻击。这些事实似乎表明，LPS不是副猪嗜血杆菌的主要毒力因子。（2）细胞膨胀毒素(CDT)是由CdtA、CdtB和CdtC3个亚基组成的不耐热细胞毒素蛋白，能够阻断弯曲杆菌、杜克雷嗜血杆菌、放线杆菌和致病性大肠杆菌等的细胞周期，诱导细胞膨胀、细胞核扩大并最终凋亡，对于弯曲杆菌和放线杆菌它也参与对宿主细胞的黏附与入侵。CdtB部分氨基酸序列与DNAaseI家族相似，且纯化的CdtB能够表现DNA酶活性，当其在CdtA和CdtC协同进入宿主细胞后，CdtB就会进入细胞核引起DNA损伤。Zang等(2012)通过构建HpsSC096株的CdtA、CdtB、CdtA和CdtB缺失菌株，发现缺失后细菌对补体介导的血清杀菌作用更敏感，同时对猪脐静脉血管内皮细胞和猪肾上皮细胞的黏附能力下降。Hps5型存在高度相似的2段编码CDT蛋白基因，通过位点特异迭代BLAAST发现与哺乳动物的DNAaseI序列相比，Hps的CdtB基因有较远亲缘关系，说明CdtB在功能上保守。通过流式细胞术分别对3种CDT蛋白及其组合对细胞分裂的影响进行分析，发现当3种蛋白同时存在时能够最大程度阻断细胞分裂并使其停滞在G2期，而单独的CdtA或CdtC或两者混合物却不能阻断细胞分裂，这与其他菌科细菌CDT作用一致。超螺旋质粒鉴定His-Tag-CdtB证明其有DNA酶活性，而其余5种敲除了酶活性中心的CdtB突变蛋白则丢失了DNA酶活性。同时发现CdtC具有一段胆固醇识别氨基酸(CRAC)序列，缺失这一序列后其对细胞毒性降低，说明发挥细胞毒性作用依赖于胆固醇的存在。对所有15个血清型Hps和109株临床分离株进行Westernblotting分析结果发现所有菌株都表达CDT并能够发挥细胞毒性，这说明在Hps中CDT可能是一个保守的毒力因子(Mao和DiRienzo，2002)。

7 小结

综上所述，副猪嗜血杆菌病对养猪业的危害正日益加重，但是在副猪嗜血杆菌毒力方面尤其是毒力因子和毒力基因在致病过程中的作用仍存在很多争议，这是副猪嗜血杆菌致病机理研究的难点之一，也是能否有效防控该病的关键所在。近年来，近年来，随着分子生物学、细胞生物学、生物化学、结构生物学和组织病理学等技术的深度融合，对Hps的部分毒力因子已有了比较深入了解，并且一些新的毒力因子不断被发现。Hps的致病性是多种毒力因子共同作用的结果，各毒力因子的作用机理以及它们之间的相互作用与关系尚不是十分清楚，今后可从分子角度进一步明确各毒力因子基因表达和调控与致病性的关系，研究强毒力菌株与弱毒力菌株之间的分子差异，探索Hps致病过程中新的毒力因子以及各毒力因子之间相互作用的关系，以期为今后副猪嗜血杆菌致病性研究提供有效借鉴。

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1007-1733(2017)05-0057-04

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