细胞悬浮培养在口蹄疫疫苗中的研究进展

刘 萍 董金杰

（中农威特生物科技股份有限公司 甘肃 兰州 730046）

文献综述

细胞悬浮培养在口蹄疫疫苗中的研究进展

刘 萍 董金杰*

（中农威特生物科技股份有限公司 甘肃 兰州 730046）

2009年以前，国内的口蹄疫疫苗生产企业毫无例外均采用传统的细胞转瓶贴壁培养的方式来生产口疫疫苗，这一方式己延续多年，为防控口蹄疫起到了非常重要的作用，但由于转瓶数量众多，占用车间面积大、手工操作、生产效率低下，且细胞密度低，因此悬浮培养成为兽用疫苗技术和质量发展瓶颈。悬浮培养在国外已成功应用于口蹄疫病毒疫苗的生产，其优点是各种环境因素的监测与控制更为方便，培养条件稳定，由于在连续封闭的系统中进行，使操作步骤简化，污染的机会也显著降低。2009年4月，随着金宇保灵生物药品有限公司用生物反应器生产牛口蹄疫疫苗获得注册批准，标志着国内用生物反应器悬浮培养细胞生产兽用疫苗的时代的到来。

1 悬浮培养技术在生物制药中的应用历史和现状

（1）1962年，Capstick等对BHK-21细胞驯化实现悬浮培并用于兽用疫苗生产。1967年，Van Wezel开发了微载体并实现在生物反应器中大规模培养贴壁细胞。悬浮培养与微载体培养标志着细胞大规模培养技术的开始，细胞生产病毒疫苗也成为细胞大规模培养技术生产生物制品的第一次浪潮。20世纪80年代后，CHO细胞实现悬浮培养，治疗性抗体生产技术的发展极大地推动着生物反应器在生物制药行业中的应用，到20世纪末已进入万升级规模。2000年以后，随着流加培养、灌注培养、个性化细胞培养基等技术的发展，作为大规模培养主要设备的生物反应器规模也趋向大型化和简单化。现在，全球l0000L及以上体积的反应器达100多台，最大已达25000L，且几乎都是可以放大的机械搅拌式反应器，主要为Gene-tech，Amgen，Boehringer Ingelheim和Lonza等公司所拥有。当前生物制药的主流技术是在大型机械搅拌式反应器中，用无血清培养基和流加培养工艺悬浮培养细胞进行生产[1]。（2）动物细胞大规模培养生产生物制品的应用领域在快速发展。2007年全球销售额最高的6大类生物技术药物中，有5类是经哺乳动物细胞表达生产的。现代基因工程技术及个性化培养基技术的发展，促进细胞培养制药的快速进展，例如开发出MDCK细胞在反应器中悬浮培养生产流感疫苗以代替传统的鸡胚生产，10L密度为106个/ml的细胞产能相当于10000只鸡胚的抗原产量。国际知名厂家纷纷进行细胞改造筛选，发展自己的细胞培养平台进行流感疫苗的生产，包括Baxte:公司的Vero细胞平台、Crucell公司和赛诺菲巴斯德的PERC6细胞平台、诺华公司的MDCK细胞平台等。（3）纵观国内，人用和兽用疫苗生产企业已超过110家，应用反应器悬浮培养技术生产口蹄疫疫苗的就有5家。一般兽用疫苗企业可采用国内自主开发的3000L反应器生产口蹄疫疫苗[2]。（4）我国“七五”至“八五”攻关期间立项研发动物细胞生物反应器，但由于细胞悬浮培养技术要求高、壁垒大，研发单位在未掌握核心技术的情况下，仅凭模仿很难实现产业化，国产细胞生物反应器在2008年以前几乎是空自白；由于细胞株等上游配套技术落后、缺乏个性化细胞培养基支持以及生化工程研究等原因，成为细胞大规模培养技术一直难以突破技术瓶劲。《中国生物技术产业发展报告(2005)》指出：自主综合支撑技术是大规模悬浮培养技术在我国实现产业化最难以跨越的技术“门槛”。

2 悬浮培养工艺中的关键技术

生物制品生产过程研发的两个主要目的是提高产率、保证产物的质量和过程工艺设计的一致性，前者直接关系到商业化生产的可行性，后者则关系到药物的安全和有效性。对应悬浮培养技术主要包括高表达细胞株的获得、个性化培养基的研发、动物细胞反应器及配套设施的完善及生产工艺的优化等四个方面。

2.1 细胞与毒株的驯化与保藏

为提高生物制品的产率和安全有效性，在生物反应器中繁殖的病毒与细胞需要进行相互适应选择，针对不同的毒株及其表达量筛选适合的宿主细胞对于细胞大规模生产具有重要意义。

2.1.1 细胞的筛选驯化和保藏 （1）实现悬浮培养首先需要选择合适的宿主细胞，细胞系的特征直接影响放大的可能性以及放大技术的选择。同一种细胞在悬浮培养和贴壁培养时对同一病毒的敏感性不同；同一株细胞不同的克隆对营养条件有不同的需求，对病毒敏感性亦可能不同。（2）通常根据毒株特性，综合考虑所用毒株能在何种细胞上增殖、表达，悬浮或贴壁细胞属性是否适合大规模培养，规模和技术是否影响表达的稳定性，能否进行驯化，驯化后毒株的敏感性和表达量是否有变化等因素选择合适的宿主细胞。细胞和毒株的筛选驯化非常重要，尤其对于贴壁细胞。因微载体悬浮培养比全悬浮培养成本高，所以一些国际知名企业对Vero细胞、MDCK细胞及PER-C6细胞进行悬浮化培养并已获成功。（3）细胞筛选驯化的实质是应用现代细胞生物学技术，在降低细胞凋亡率、提高细胞活力、延长细胞生命周期、提高产物浓度等方面进行研究，结合特定细胞的营养需求进行培养基优化，筛选适用于生产的细胞株。Louza公司在2005年采用普通CHOKl细胞株和转染克隆筛选后的悬浮突变细胞株CHOK1 SV进行蛋自表达能力对比，发现筛选后的细胞蛋白表达能力提高了4-5倍。Chia chu等也通过转染技术克隆筛选出悬浮的MDCK细胞株[3]。（4）为实现驯化的稳定，通常由高密度细胞培养转向低密度细胞培养，由高浓度血清培养逐渐降低血清浓度进行培养。因细胞损伤后难以修复，所以驯化时细胞活力应保持在90%以上。细胞的增殖能力直接影响产能，驯化时应保持对其增殖能力的测定。细胞驯化时还应对其表达分泌能力进行测定，避免驯化后的细胞表达特性发生变化。驯化后细胞的增殖能力、活力及生产能力要能够满足工业大规模生产的需要。由于特定细胞的营养需求不同，实现其驯化的难易程度也不同，在驯化时需要选用合适的细胞培养基，有针对性地调正某些营养成分以满足细胞的特定需求，使驯化好的细胞可以保持其悬浮或是无血清生长的特性。与20世纪80年代相比，由于细胞培养基技术的发展，细胞驯化变得相对容易。（5）在筛选驯化过程中应注意及时对细胞进行保藏，以避免在培养过程中出现异常情况导致筛选驯化工作量的重复和时间浪费。保藏时，应选用在该驯化条件下细胞状态良好的细胞。

2.1.2 病毒对细胞的敏感性关系 （1）培养动物细胞的目的是通过细胞制备足够量的病毒，因此，毒株对细胞的敏感性非常重要。但在实际应用中，毒株对细胞的敏感性、差异性较大。不同细胞对同一病毒敏感性不同，同一细胞对不同病毒株敏感性不同；悬浮细胞和贴壁细胞的敏感性不同；同一病毒株可在多种宿主细胞上生长，一种细胞系平台也可能生产多种病毒；同一细胞不同培养方式的病毒量、抗原结构、免疫原性、毒力等也可能不同。如狂犬病毒PM毒株从最初的兔脊髓制备，经过多种(次)细胞适应和传代，发展到现在采用Vero细胞制备，使狂犬病疫苗的生产率明显提高;而狂犬病毒Flury LEP株也从最初的鸡胚成纤维细胞生产发展到BHK21细胞生产，并进一步适应了反应器悬浮培养等。（2）当病毒对一些细胞基质不够敏感时，可以通过代驯化的方式，使病毒逐步适应该细胞基质，最早满足生产疫苗的需求。（3）在优化培养工艺的基础上，作为种源的毒株及细胞株的筛选优化，提高细胞培养的质量和病表达量已是当前提高产率的一个技术要点，也是低成本、提高生产竟争力的关键之一。诺华公司用来自于ATCC的血清依赖型MDCK细胞株进行驯化筛选，形成了在无血清无蛋自条件下悬浮培养的流感病毒专用MDCK细胞株[4]。

2.2 细胞培养基的个性化和优化

（1）瑞士联邦科技学会生物工艺学教授Wurm博士在2005年即指培养基虽不是细胞培养中唯一重要因素，但确是最重要的一种。尤其在大规模培养技术中，维持细胞高密度甚至无血清生长，细胞培养基的营养含量对细胞的增殖、维持至关重要。在悬浮培养技术中，不同细胞营养代谢的特异性不同，细胞和病毒培养工艺不同，需要抗剪切力、满足放大功能，还需要提高目标生物制品的稳定性、表达量，这些均需要个性化培养基的支持。Louza公司2005年研究结果表明，采用优化后的限定化学成分细胞培养基与目录细胞培养基相比，蛋白表达量提高了9.6倍。（2）个性化细胞培养基在国外生物制品生产中被普遍采用，生物制药公司往往与细胞培养基企业建立合同服务关系，研制最适合的个性化细胞培养基用于生产，由细胞培养基企业为用户提供细胞培养基定制以及相关技术支持，帮助他们最大程度地提高生产效率。为用户定制细胞培养基是世界几大细胞培养基制造商业务的主要部分，而公开的目录细胞培养基产品仅占其业务的10%～30%。但是我国销售的细胞培养基却多为20世纪50年代发明的MEM，DMEM，199 ，RPMI1640细胞培养基等，这些目录产品难以满足生物反应器大规模培养动物细胞的技术要求，直接影响了生物制药行业技术升级。（3）细胞培养基经过天然培养基、合成培养基，发展到无血清培养基、无蛋白培养基、限定化学成分培养基。近百年的发展，已发生质的飞跃。无血清培养基杜绝了血清的外源性污染和对细胞毒性作用，使产品易于纯化、回收率高；其成分明确，有利于研究细胞的生理调节机制；还可根据不同细胞株设计和优化适合其高密度生长或高水平表达的培养基。从对人类和动物安全性的长远考虑，生物制品生产越来越倾向采用无血清无动物组分培养基，国际上生物制药生产中，已经有50%以上采用无血清细胞培养基。

2.3 细胞培养工艺的研发

悬浮培养过程技术的开发和应用主要是生产工艺的开发和工艺过程优化，维持细胞生长和病毒繁殖的最优化环境控制，在悬浮培养技术中的作用同样至关重要。

2.3.1 悬浮培养和微载体培养工艺 （1）悬浮培养技术按细胞贴壁性分为悬浮细胞培养工艺和贴壁细胞微载体悬浮培养工艺。悬浮细胞(CHO细胞、BHK21细胞等)可以在反应器中直接生产增殖，细胞自由生长、培养环境均一、取样简单、培养操作简单可控、放大方便、污染率和成本低；而贴壁细胞在反应器中悬浮培养需要借助微载体，细胞和球体接触部位营养环境较差，培养、取样观察及放大工艺复杂，成本高。虽然相对于悬浮培养，微载体培养工艺复杂，但与转瓶培养相比仍有很大优势，能提高生产规模、产品质量和劳动效率，因此是贴壁细胞悬浮培养的主要手段。巴斯德公司利用1000 L反应器微载体培养Vero细胞生产人用狂犬病疫苗和脊髓灰质炎疫苗，Baxte公司微载体培养细胞工艺已达6000L规模。（2）微载体对细胞附着、细胞的进一步扩展和重组蛋白的表达有较大影响。常见的微载体有实体的Cytodex微载体、片状的DISK微载体及多孔的Cytopore微载体。使用DISK或Cytopore时细胞贴附于载体内部生长，表面细胞较少，难以使用细胞消化等方法将载体和细胞进行分离，且反应器放大工艺困难，不适合非释放病毒的培养。而Cytodex比较适应罐倒罐的反应器放大工艺，目前报道的贴壁细胞生产工艺的最佳形式是机械搅拌式反应器实体微载体悬浮培养系统，可实现最有效的优化工艺和最适宜的工艺设计，其最佳工艺设计体现于高密度连续灌流培养。清大大一公司在微载体悬浮培养Vero细胞、MARC145细胞和ST细胞等工艺技术方面同样取得了较好的进展[5]。

2.3.2 悬浮培养工艺及选择细胞悬浮培养工艺 （1）按照培养方式分为批培养、流加培养及灌注培养。批培养能直观反映细胞在生物反应器中的生长、代谢变化，操作简单，但初期代谢废产物较多，抑制细胞生长，细胞生长密度不高;流加培养操作简单、产率高、容易放大，应用广泛，但需要进行流加培养基的设计；灌注培养的培养体积小，回收体积大，产品在罐内停留时间短，可及时回收到低温下保存，利于保持产品的活性，但操作比较繁杂、细胞培养基利用效率低、旋转过滤器容易堵塞等。（2）不同的病毒采用的培养方式不同，如对于分泌型且产品活性降低较快的生物制品，宜采用灌注培养，且灌注培养也更适宜于微载体培养。

2.3.3 悬浮培养过程参数控制 （1）选定合适的生产工艺后，过程控制成为关键。为确保细胞生长在最优环境中，需要利用反应器的在线监控功能控制各种运行参数。（2）细胞对温度较敏感，需要采用合适的加热或冷却方式控制培养温度在35～37 ,℃避免细胞受到损伤。动物细胞生长适宜的pH范围一般在6.8～7.3之间，低于6.8或高于7.3都可能会对细胞生长产生不利的影响。Lonza公司针对CHO细胞在pH值分别为7.0和7.3条件下进行培养，结果表明，pH7.0时细胞密度是pH7.3的近2倍，生产率是其2.5倍。因此在培养过程中，合适的pH控制对于整体产率具有较大的影响。溶氧浓度控制同样重要，其需求范围通常为20%～60%的空气饱和度，在控制溶氧的过程中，应注意通气量，避免气泡的破裂对细胞的损伤；同时通气量会影响pH值，需要综合考虑。在培养过程中还需要控制细胞培养液的渗透压，大多数动物细胞的适宜渗透压范围是280～320mOsm/kg H2O左右，在使用碳酸钠或碳酸氢钠来控制pH值的同时，需检测渗透压是否在正常范围之内。（3）还要进行流加方式、灌流速率及代谢的控制等。在整个过程控制中，各个参数不是单一运行，且相互影响，需要进行全面控制。

2.4 生物反应器的选择

（1）反应器规模能否放大是选择反应器的一个重要前提，悬浮培养规模的放大主要通过增加反应器体积或者增加反应器数量，增大反应器体积可以节省大量的配套工程及人员成本，而多台小的反应器虽然操作灵活，但成本相对高。在国外生物制品生产中采用的多是较大规模的、能够逐级放大的生物反应器。（2）选择和配置生物反应器还需考虑和满足生产工艺和产能需求。反应器接口的标准化、配件提供速度及售后服务质量等，均应作为工业化选用生物反应器考虑的因素，以免造成生产的延误。

3 展望

快速实现悬浮培养技术生产口蹄疫病毒疫苗将是未来几年口蹄疫病毒疫苗生产的重点。目前正在上线的悬浮培养工艺是中农威特生物科技股份有限公司投资建设的最先进的现代化动物疫苗生产线，项目完成后，中农威特科技股份有限公司将成为国内最大的细胞悬浮培养口蹄疫疫苗生产基地。随着悬浮培养技术在疫苗生产中逐渐成熟，将在国内大范围内推广应用。当然在技术发展的同时还应该认识到快速实现悬浮培养技术在疫苗生产中的应用只是搭建了一个升级的工艺平台，而不是最终目的，发展真正的动力是新药、新疫苗、新工艺及配套技术的创新。

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[2] 杨学义, 刘飞, 向双云等. 哺乳动物细胞无血清培养基研究进展[J]. 动物医学进展, 2011, 32(2): 69-72.

[3] Ning F, Guo Y S, Tang Juan, et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into dental epitheliallike cells induced by ameloblasts serumfree conditioned medium[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2010, 394(2): 342-347.

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S852.65+9

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1007-1733(2017)05-0054-03

2017–01–16）

*通讯作者