中国人群常见的药物代谢相关基因多态位点及其检测方法

杨琳艳 杨旭 范冬梅 梁志坤 叶倩平 杨学习

中国人群常见的药物代谢相关基因多态位点及其检测方法

杨琳艳1杨旭1范冬梅1梁志坤1叶倩平1杨学习2★

药物代谢个体差异的一个重要来源是遗传多态性即药物代谢相关基因的多态性。中国人群中药物代谢酶基因多态性的系统性分析已发现了很多潜在的功能性多态性位点，因此建立起针对中国人群的药物代谢酶基因多态性的检测技术，对常见的药物代谢相关基因多态位点的检测以及针对这些多态性位点建立个性化用药技术具有重要的意义。检测药物代谢基因多态性大多采用传统的聚合酶链式反应（PCR）和限制性片段长度多态性（RFLP）等方法，随着基因诊断的快速发展，高通量、快速准确的基因多态性检测方法开始发展起来，如基因芯片法、下一代测序技术等。本文对药物代谢酶基因多态性位点及其检测方法进行综述。

药物代谢；基因多态性；下一代测序技术

药物在体内的作用过程包括药物的吸收、生物转化、分布和排泄等一系列过程。而其中的生物转化即为药物代谢，指的是药物在体内经过吸收、重新分布以后，在药物酶的作用下其化学结构发生一系列变化的过程。药物化学结构的变化包括其化学成分分子的缩合、降解以及分子功能团的增减和变换等。经生物转化后，药物相应的理化性质随之发生改变，进而导致其毒理和药理活性的变化［1⁃2］。对药物的代谢过程进行研究可以明确药物中发挥药效的活性成分，阐明药物的科学内涵，促进质量控制和剂型改进，进而指导临床用药。因此药物代谢研究对临床用药具有重要的指导意义。

作者单位：1.广州市达瑞生物技术股份有限公司，广东，广州510665
2.南方医科大学检验与生物技术学院，广东，广州510515

遗传因素和环境因素共同影响着药物代谢酶活性的个体差异。其中与药物效应密切相关的药物相关基因即编码体内关键药物代谢酶的基因发生变化是主要的遗传影响因素。药物相关基因发生的诸如单核苷酸多态性、基因缺失或重复等分子结构变异，可能会引起药物在作用靶点、转运蛋白和代谢酶等水平上发生遗传差异，从而引起药物在体内的药效和代谢发生变化，对药物的治疗效果产生影响，甚至会出现严重的药物不良反应，进而造成药物代谢和反应的个体差异［3］。

与药物效应相关的基因型分布具有较大的种族与地区差异，很多欧美人群的相关数据不能直接应用到中国人群。建立起中国人群药物代谢酶基因多态性检测技术，对常见的药物代谢相关基因多态位点的检测以及针对这些多态性位点建立个性化用药技术具有重要的意义。

本文在前人研究的基础上，对中国人群常见的药物代谢相关基因的多态位点及其对药物代谢过程的影响、常用检测方法特别是下一代测序技术在药物代谢基因多态性的检测中的应用进行综述。

1 中国人群中常见药物代谢相关基因的多态位点及其在药物代谢中的作用

1.1 P450酶系及相关调控基因

CYP450在还原状态下可以和一氧化碳相结合，在450 nm的波长处有最大吸收峰，是存在于人体肝脏的具有混合功能的氧化酶。CYP450是药物代谢的最主要途径，是最重要的药物代谢酶系，其负责的药物代谢超过80%，催化的氧化反应类型极广，与代谢性药物的相互作用关系也最为密切［4］。

CYP450的活性存在种族和个体差异，即具有遗传多态性。用药情况应根据患者的个体情况而异，这就需要首先确定患者与药物代谢相关的基因型，接着对其代谢类型做出判断，进而针对不同的个体确定不同的用药量，以达到最好的疗效。但从临床用药的现状来看，个体化用药的目标还远没有实现，主要原因有：一是CYP450s基因型鉴定技术还不完善；二是CYP450s基因型与表现型的关系研究得还不够深入［5］。因此，针对这一现状，发展经济、高效、准确的CYP450s相关基因型鉴定技术，深入开展CYP450s基因型与表现型关系的研究工作对于降低药物不良反应、指导个体化临床用药具有重要意义。

1.1.1 CYP1A2

CYP1A2在人类肝脏中普遍存在，在肝脏的线粒体和内质网中有大量分布，脑、肠道、肺等组织中有少量的分布，约占肝脏CYP450酶总量的13%［6］。CYP1A2主要的突变体为CYP1A2*11，是由CYP1A2基因c.558C＞A的突变引起其蛋白质（p.Phe186Leu）的改变，进而导致其酶活性的降低。CYP1A2*7是由于c.1253+1G＞A突变引起剪切缺陷（splicing defect）［5］。

1.1.2 CYP2C8

占CYP2C亚族26%的CYP2C8酶，在肝脏中的含量较高，占肝酶总量的7%，在肝外其他组织中也有少量的分布，是CYP2C亚族成员中发现最晚的一个［7］。据统计，临床上约5%的药物代谢需CYP2C8的参与，另外该酶在血管紧张度和血压的调节以及一些内源化合物的代谢过程中也发挥着重要作用［8］。

已经报道的CYP2C8突变体有20多种，其分布特点是具有明显的地区性和种族性。其中，CYP2C8*2的突变频率为6%～28%，主要见于黑种人中。突变频率分别为13%和6%左右的CYP2C8*3和CYP2C8*42种突变体主要分布在白种人中［9］。而CYP2C8*5至CYP2C8*14的突变体突变频率很低（＜0.2%），主要见于亚洲人群［10］。

1.1.3 CYP2C9

CYP2C9同样也具有基因多态性，据报道至少存在2种不同的等位基因即CYP2C9*2和*3［11］。作为CYP2C亚家族的主要成员，CYP2C9*3是中国人群中最常见的突变型，占8%～10%，而其他突变型占不到1%［12］，CYP2C9具有显著的地区和种族差异。基因突变后可能会导致酶活力的下降，进而引起代谢能力的降低，CYP2C9*3突变是其酶活性下降的主要原因。

CYP2C9基因编码区有多处单核苷酸多态存在。第一个被发现的是CYP2C9*2，由于3号外显子的430位C＞T，导致144位Arg变为Cys。CYP2C9*2与CYP2C9*1相比缺少AvaⅡ的识别位点（GGACT），因此可以使用 PCR检测 P450CYP2C9*2。第二个多态的位点是CYP2C9*3，7号外显子的1075位A＞C，导致359位的Ile变为Leu。CYP2C9*4是一种很少出现的等位基因，只在一位日本病人中发现过，在日本的健康人和其他人种中均未发现过，该基因7号外显子的1076位T＞C，导致359位 Ile变为 Thr［13］。

1.1.4 CYP2C19

De Morais等［14］发现弱代谢者产生的主要原因是CYP2C19cDNA的5号外显子中发生c.681G＞A突变，导致了一个新的异常的拼接位点的出现，异常的拼接使位于外显子5’端的前40 bp的碱基缺失，在之后的转录过程中mRNA的阅读框架也发生改变，进而导致翻译提前终止，结果生成的蛋白质是无功能的酶蛋白，其结构上缺乏血红素结合位点。该突变体被称为CYP2C19*2。该突变存在于约73%～83%的日本人和白种人弱代谢者中［5］。另外，突变频率较高的突变体有CYP2C19*5、CYP2C19*8和CYP2C19*3等。CYP2C19*5表现为c.1297C＞T突变，并导致氨基酸产生p.Arg433Trp的改变。CYP2C19*8表现为c.358T＞C突变，导致氨基酸序列产生p.Trp120Arg的改变。而突变体CYP2C19*3则表现为c.991A＞G突变，导致氨基酸序列产生p.Ile331Val的变化，以及c.636G＞A突变［15］，导致氨基酸序列产生p.Trp212X的改变，翻译提前终止，丧失酶活性，造成弱代谢者的发生［14］。

1.1.5 CYP3A4和CYP3A5

CYP3A4是人类药物代谢酶中最主要的异构酶，约占肝脏CYP酶总量的25%［16］，肠道中也有大量CYP3A4酶的表达。临床上约有50%药物需经CYP3A4代谢［17］，该酶的代谢底物类型较多。目前为止，在中国人群中已发现的CYP3A4突变体主要有CYP3A4*3（c.1334T＞C）、CYP3A4*4（c.352A＞G）［18］、CYP3A4*5（c.653C＞G）［19］和CYP3A4*18（c.878T＞C）。FK506是常用的免疫抑制药，主要用来预防肾脏移植后免疫排斥反应。其具有比环孢素更强的免疫抑制作用和肝肾安全性。在口服FK506后，主要利用肝脏和肠道中的CYP3A4和CYP3A5进行代谢，因此推测造成FK506药物动力学个体差异的主要原因可能是CYP3A4、CYP3A5的基因多态性。在已发现的CYP3A4的数十个SNPs中，IVS10上的CYP3A4*18B（82266G＞A）是目前在中国人群中最高发的突变体［20］。与CYP3A4基因相似，CYP3A5基因具有很大的表达差异性，其中最常见的突变体是CYP3A5*3，即IVS3上产生c.219⁃237A＞G突变，进而导致异常剪切的mRNA的形成，编码形成的蛋白质表现出不稳定的特性，CYP3A5代谢酶在携带该突变的患者体内不表达，导致对相应底物的代谢效率下降，因此该突变被认为是影响CYP3A5蛋白表达水平的最主要因素［21］。

1.1.6 CYP2E1

CYP2E1的代谢底物较多，其中大部分为前毒物和前致癌物，少部分为药物。该基因也具有基因多态性。在中国人群中主要发现两种该基因的突变体，即CYP2E1*2和CYP2E1*3。CYP2E1*2表现为c.227G＞A突变，并引起氨基酸p.Arg76His的改变，进而导致其酶活性降低。CYP2E1*3则表现为c.1165G＞A突变，并引起氨基酸p.Val389Ile改变的产生，但对酶活性并无明显影响［22］。

1.1.7 CYP2D6

研究表明CYP2D6酶参与临床上20%～25%的常用处方药的药物代谢［23］，如异喹胍（肾上腺素能阻断药物）、司巴丁等。CYP2D6已知的等位基因变异超过了90个，同样也具有基因多态性，其中某些突变导致弱代谢表型的产生，使代谢能力下降，某些突变导致强代谢表型的产生，使代谢能力增加［24］。

CYP2D6的基因多态性具有种族和地区差异，在高加索人和非洲人群中，CYP2D6*5的突变频率类似，在东方人群中没有发现CYP2D6*3和CYP2D6*4突变的存在，因此只有很少的慢代谢者。在中国人群和日本人群中发现了CYP2D6*10突变体，表现为氨基酸p.Pro34Ser突变的产生，这是导致东方人CYP2D6酶活性降低的主要原因［25］。据统计东方人的CYP2D6*10基因突变频率高达50%，而高加索人仅为5%，这是后者代谢率高于前者的重要原因［24］。

1.2 叶酸代谢关键酶

甲硫氨酸合酶还原酶（methionine synthase re⁃ducta，MTRR）和亚甲基四氢叶酸还原酶（methy⁃lenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）等是叶酸代谢过程中的关键酶。叶酸相关代谢酶的编码基因同样也存在单核苷酸多态性，例如常见的MTRR基因的c.66A＞G、MTHFR基因的c.665C＞T突变和c.1286A＞C突变，这些突变可能会影响其相应编码产物的活性，进而影响叶酸的代谢［26］。

综上所述，细胞色素P450与叶酸代谢关键酶都具有遗传多态现象，其酶的活性存在明显的种族和个体差异。药物代谢酶的多态性是药物作用个体差异的分子基础，因此，从理论上讲，临床用药也应该根据其特点因人而异，实行个体化用药，而这要求我们首先要有简便、快速、较成熟的药物代谢酶基因的基因型鉴定技术，进而明确基因型与表型之间的关系，最终推动个体化用药的发展和实施。

2 药物代谢基因多态性研究的方法

药物代谢酶特别是细胞色素P450介导的药物代谢是药物体内代谢过程的关键环节，是机体药物暴露、潜在毒性以及发挥疗效的重要决定因素。加强相关药物代谢催化活性分析研究，对于揭示药物的代谢调控机制、生物氧化机理以及新药筛选评价的新方法和新技术的发展具有十分重要的理论和现实意义。随着药物代谢相关基因结构与功能研究的深入，相关的交叉学科和新技术的引入与融合，促进了药物代谢细胞色素酶催化活性检测技术研究的快速发展。近年来在药物代谢产物及其结构分析方面有了长足的发展，气相色谱法（gas chromatography，GC）、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）和毛细管电泳法（capillary electrophoresis，CE）都可以用来检测药物的代谢产物。如果体内代谢产物的含量较高，首先可以累积制备相应代谢产物，然后借助核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）的方法对其结构进行分析。目前质谱法药物分析应用广泛，特别是色谱与质谱联用，为药物代谢产物的分离、鉴定提供了快速、有效的分析手段。

国外所报道的有关药物代谢相关基因多态性的资料多为西方人群资料，而中国人群相关数据知之甚少。随着药物基组学和基因检测技术的发展，通过对中国人群重要药物代谢酶基因多态性的系统性分析，发现了很多潜在的功能性多态位点，建立起中国人群药物代谢酶基因多态性检测技术，对常见的药物代谢相关基因多态位点的检测以及针对这些多态性位点建立个性化用药技术具有重要的意义。林莉等［27］曾利用实时荧光PCR法检测DPYD*9等位基因的单核苷酸突变，对PCR产物进行熔解曲线分析以确定基因型，虽然这种方法通用性好而且价格较低，但是从质粒DNA标准品的构建到设计引物再到荧光定量PCR以及Sanger测序验证，实验操作复杂。娄莹等［28］利用直接测序法检测VKORC1、CYP2C9等6种基因多态性对中国汉族人群华法林稳定剂量的影响，结果发现VKORC1⁃1639G＞A、CYP2C9*3，是影响中国人华法林稳定剂量的最主要的遗传因素，检测上述2种基因多态性对指导华法林个体化用药有一定的临床意义。

目前在检测药物代谢基因多态性方面，人们倾向于采用限制性片段长度多态性和聚合酶链式反应的方法。2010年李宗吉等［29］利用该技术对宁夏回族人群CYP3A4*6等位基因多态性进行了研究，证实了在宁夏回族人群中CYP3A4基因的第9号外显子区有突变存在，其等位基因的突变频率为0.005。限制性片段长度多态性聚合酶链反应（polymerase chain reaction⁃restriction fragment length polymorphism，PCR⁃RFLP）比较成熟，但是由于更多高效的方法被开发，现在仅在一些经济条件较一般的实验室应用。该技术的优点是操作简单、特异性高、重复性好，且能对未知点突变进行分析，但是对于己知序列的点突变而言则操作起来并不是十分简便，因为并不是所有的突变位点都可以与其邻近碱基构成酶切位点，而某些内切酶价格特别昂贵也会大大增加检测成本，现在大多是结合其他方法进行点突变筛查［30］。

在药物基因组学研究的初期阶段，建立快速、高通量、准确的基因多态性检测和基因分型技术是对大量受试人群进行筛查、对群体样本进行统计以及对基因功能进行分析的关键。基因芯片技术是近年发展起来的一种程序化、自动化、规模化的分析基因结构与研究基因表达的新型技术，可同时进行多位点、多基因的多态性分型检测，具有灵敏度高、信息容量大等特点，因此在基因分型方面有一定的应用和发展空间。但其缺点是芯片造价成本较为高昂，并不能广泛使用于临床检验。

DNA测序技术从以Sanger法为代表的第一代测序技术发展到如今的高通量测序（high⁃through⁃put sequencing，HTS）技术［31］，经历了曲折而漫长的发展过程。随着基因诊断技术的迅速发展，对大规模的基因组进行更加精细化的研究成为一种客观需要，这就要求对基因组进行深度以及重复测序，这时具有低成本、高通量、高自动化程度等特征的下一代测序技术应运而生，该技术在很短的时间内能够实现对上百亿个碱基对进行测序的愿望，一次就可以测定几十万到几百万条DNA分子的序列，这满足了极短时间内对基因组进行高分辨率检测的要求［32］。这种高通量的测序技术不仅可以一次并行测定几十万到几百万条DNA分子的序列，而且读长一般较短。该技术极大地促进了胎儿游离DNA（cell free fetal DNA）的实验室研究，促进了无创性产前基因诊断的发展。目前基于NGS平台，建立胎儿21、18、13三体综合征的产前基因诊断技术已应用于临床，其他如性染色体非整倍体、双胎妊娠染色体非整倍体、胎儿染色体结构异常疾病、孟德尔单基因病以及妊娠相关疾病的研究也因NGS的出现获得了显著的进步。该技术还具有挖掘信息多的特点，因其采用了多通道测序，能反应丰富的物种信息，加之愈发丰富的各种数据库，能直接反应出代谢情况及信号通路等。杨琳、卢宇蓝等［33］为探讨阿司匹林药物相关基因位点在不同种族人群中等位基因频率差异，采用高通量核苷酸测序技术对人类阿司匹林遗传多态基因性位点进行全外显子组测序，检测数据共涉及38个阿司匹林药物相关的多态性位点，共33个基因。其中10个变异位点（26%）影响药物有效性；28个变异位点（74%）影响药物毒性和（或）不良反应。另外杨琳、董辰等［34］采用全外显子组测序的方法，对12个基因中27个药物相关的多态性位点进行检测，探讨了华法林药动和药效相关基因位点的人群频率差异，为华法林药物基因组学研究提供了基础数据。由此可见，在药物代谢基因多态性检测中应用高通量测序技术是可行的，而且将是一种趋势。虽然目前该方法在药物代谢基因多态位点的检测中还没有得到广泛的应用，但是随着高通量测序技术的发展，它给人类带来的方便以及福利不断地展现出来，而且已经成为临床诊断和科研的热点，药物基因组学的快速发展、特别是药物代谢机理的阐明都需要这样的技术来推动，相信不久的将来，高通量测序在CYP450等药物代谢基因多态性的研究中将会占有一席之地。

3 前景展望

从第一代Sanger测序法的问世，到如今各种高通量测序技术被广泛应用，海量的遗传奥秘陆续被揭开，而且测序技术一直向着耗资少、速度快、准确率高以及高通量的方向发展。测序技术不断地给生命科学和生物医学研究领域带来新的突破与发现。基因检测成为临床诊断和科学研究的热点，得到了突飞猛进的发展，不断涌现出越来越多的科研和临床新成果。而且，基因检测已经从单一的遗传疾病范畴扩展到复杂疾病和个体化应用等更加广阔的领域，其临床检测范围包括遗传疾病的诊断和基因携带的检测以及基因药物检测，应用范围也不断扩大，目前可用于指导个体化用药等诸多方面的研究。随着药物基因组学和遗传药理学的深入研究与发展，药物代谢机理和途径及其相关的遗传学基础得以阐明，患者的药物代谢相关遗传信息可通过高通量的半导体测序快速、高效的获得，并被存储备份由本人保管。在患者就医过程中，医生可根据患者携带的药物代谢相关的基因型资料，分析患者的药物基因多态性，并提供合理的药物选择以及给药剂量，使给药方案更加合理并具有更强的可实施性。这样医生就可以科学地有根据地决定该使用哪种药物，使用剂量如何，使治疗效果达到最佳。与此同时可以不必采取事后补救措施来弥补药物不良反应带来的恶果，从根本上预防和降低药物的不良反应的发生，最大限度地减轻患者的痛苦和经济负担。因此药物相关的基因检测，将会推动药物治疗向着安全性和有效性的方向发展。需要注意的是应用高通量测序的手段进行药物代谢相关基因多态性检测时，必须使测序的反应条件及体系标准化，同时做好质控，避免出现不必要错误。

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Common gene⁃related polymorphisms of drug metabolism in Chinese population and their detection methods

YANG Linyan1,YANG Xu1,FAN Dongmei1,LIANG Zhikun1,YE Qianping1,YANG Xuexi2★
(1.Guangzhou Darui Biotechnology Co.,Ltd.,Guangzhou,Guangdong,China,510665;2.School of Laboratory Medicine and Biotechnology,Southern Medical University,Guangzhou,Guangdong,China,510515)

An important source of individual differences in drug metabolism is genetic polymorphism which relates to polymorphisms of drug metabolizing genes.A systematic analysis for polymorphisms of drug metabolizing enzyme genes in Chinese population has identified many potential functional SNPs.Establishment of an assay for the drug metabolizing enzyme gene polymorphisms in Chinese population is very significant.The methods based on conventional polymerase chain reaction(PCR)and restriction fragment length polymorphism(RFLP)are traditionally used to detect polymorphisms of drug metabolizing genes.With the rapid development of gene diagnosis,high throughput,fast and accurate genetic polymorphism detection methods,such as gene microarray,next generation sequencing,have been developed for it.This review focuses on the drug metabolizing enzyme gene polymorphisms and detection methods and the recent progress is also discussed.

Drug metabolism;Genetic polymorphism;Next generation sequencing

广州市科技计划项目（201508020259）

★通讯作者：杨学习，E⁃mail：yxxzb@sohu.com