急性白血病微小残留病检测方法临床应用的研究进展

王卫国

(阜阳市人民医院，安徽阜阳 236001)

急性白血病微小残留病检测方法临床应用的研究进展

王卫国

(阜阳市人民医院，安徽阜阳 236001)

急性白血病(AL)患者治疗后微小残留病(MRD)水平直接决定AL复发和患者的生存期。近年来，越来越多的方法用于MRD的检测，如荧光原位杂交(FISH)、聚合酶链式反应(PCR)技术、流式细胞术(FCM)、质谱技术，其预测疾病复发、评估预后等临床价值得到广泛认可，可为AL的临床干预治疗提供依据。

急性白血病；微小残留病；荧光原位杂交；聚合酶链式反应；流式细胞术；质谱技术

急性白血病(AL)是发生于造血干细胞水平的恶性肿瘤，按肿瘤细胞的分化系别不同，一般可分为急性髓细胞性白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)。AL患者治疗后体内残留的肿瘤细胞数量决定其临床结局。微小残留病(MRD)是指AL诱导化疗或骨髓移植后，达到临床和血液学的完全缓解(形态学检查骨髓中原始细胞<5%)，而体内残存微量白血病细胞的状态，是病情动态观察不可或缺的一部分。因此，监测AL患者MRD的变化非常重要。近年来，检测MRD方法不断发展，有荧光原位杂交(FISH)、聚合酶链式反应(PCR)技术、流式细胞术(FCM)、质谱技术。现将其临床应用的研究进展进行综述。

1 FISH

FISH是利用核酸探针在高分辨率中期或间期染色体上杂交，检测染色体异常的一种方法，检测MRD的灵敏度为1%左右，但若与其他技术联合，也可以是一种选择。Wang等[1]采用一种独特的Flow-FISH方法分析白血病干细胞的比例：对初诊的AML患者利用流式细胞仪分选出CD34+细胞，结合初诊时遗传学的异常结果，对分选细胞进行FISH，镜检分析FISH+CD34+CD38-细胞(白血病干细胞)的比例，发现高比例白血病干细胞(>1%)是患者2年总生存率(OS)、无事件生存率(EFS)不利因子。由于白血病干细胞的残存是AL复发的根本原因，这提示富集白血病细胞后再利用FISH检测MRD，可能是一种较好的选择。

2 PCR技术

2.1 融合基因检测 融合基因是指两个或两个以上的基因编码区首尾相连而形成的嵌合基因。目前AL被检测最常见的融合基因包括BCR-ABL、RUNX1-RUNX1T1、PML-RARα、TEL/AML1等，检测方法为逆转录PCR、多重PCR或实时定量PCR。酪氨酸激酶抑制剂是治疗慢性粒细胞白血病(Ph染色体是其标志性染色体)的首选靶向药物，但有1/4～1/3的B细胞ALL患者也伴有Ph染色体或BCR-ABL融合基因。这类患者一般预后差，以往首选的治疗方案是骨髓移植。Ravandi等[2]对Ph+ALL患者采用酪氨酸激酶抑制剂联合化疗方式进行强化治疗，监测包含BCR-ABL在内的骨髓MRD水平，发现患者若能获得首次完全缓解则可以受益于这种强化治疗。现在很多临床治疗中心采用酪氨酸激酶抑制剂联合化疗方案治疗Ph+ALL患者，该方案与骨髓移植的疗效差异并不明显[3]，其中MRD的检测为临床治疗方法的更新提供了强有力的支持。伴有染色体t(8；21)AML的融合基因为RUNX1-RUNX1T1，此类型AML治疗效果较好。伴t(8；21)AML患者异基因造血干细胞移植后，12个月内RUNX1-RUNX1T1转录本水平比诊断时下降小于3个对数级和(或)12个月后下降小于4个对数级预示着复发[4]。对儿童t(8；21)AML患者的研究也表明，1个疗程诱导缓解后RUNX1-RUNX1T1转录本下降是否大于2个对数级是影响无复发生存的独立预后因素[5]。可见，融合基因的水平及其转录本下降的水平能提前预测AL的复发，为提前的临床干预提供依据。

2.2 癌基因检测 AL患者重现性分子及遗传学异常出现频率较低，但一些癌基因如肾母细胞瘤基因1(WT1)、脑和AL胞质蛋白(BAALC)基因等会因异常活化而表达增强。WT1为AL患者较常见的过表达癌基因[6,7]，利用实时定量PCR技术检测其分子表达水平，可反映MRD水平。Lambert等[8]研究发现，诱导治疗后和疗程结束时外周血WT1 MRD阳性(>0.5%)与较高的复发率和较短的OS有关。PML-RARα表达水平是监测急性早幼粒细胞白血病MRD的标志物，其阳性意味着疾病复发，不能当作预示复发的指标。Yoon等[9]研究发现，维持治疗后第3个月高表达WT1(>120 copies/104ABL1)的急性早幼粒细胞白血病患者，具有较高的复发率和较低的无病生存期，多因素分析显示诊断时高白细胞数量和维持治疗后第3个月WT1高表达是预示复发的重要因素。可见以WT1的表达水平来监测MRD评估患者预后是一种可行的方式。AL患者BAALC表达升高可促进白血病细胞的形成，Weber等[10]用实时定量PCR技术检测正常核型AML患者BAALC转录本的表达，发现高表达BAALC与多种预后不良的基因突变有关，是预后不佳的独立影响因子，可作为一种预后风险分层和MRD监测的标志物。

2.3 基因重排检测 ALL患者除了BCR/ABL融合基因阳性率在20%～30%外，其他融合基因阳性率均较低。当前许多研究证明免疫球蛋白(Ig)或T细胞受体(TCR)基因重排是ALL细胞克隆性的分子标志，是ALL患者MRD监测应用最广泛的指标。目前检测Ig/TCR基因重排国际公认的的方法是标准化BIOMED-2 PCR，利用107对不同引物进行PCR扩增，对电泳结果阳性的标本进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，并再通过测序分析进行验证。但这种方法繁琐且成本过高，一般临床大多利用特异性引物扩增目的片段如等位基因特异性引物PCR法进行检测[11]。为了提高检测的灵敏度，Logan等[12]利用下一代高通量测序技术定量检测ALL患者Ig/TCR重排，认为只要样本充足，检测MRD敏感度可达到1×10-6，发现骨髓移植前30 d内MRD≥1×10-4与移植后的复发率有关，17例患者移植后任何时间检测到MRD≥1×10-6都复发并且死亡，这种分子水平检测到的MRD比临床复发提前89 d(中位数)，这种高灵敏度检测MRD技术能为患者复发前提供一个明确的临床干预窗。Mannis等[13]也使用下一代测序技术检测ALL患者自体干细胞移植后外周血MRD水平(Ig/TCR重排)，以探讨MRD水平与复发的关系，多变量分析结果显示，仅MRD≥1×10-6是ALL复发的独立预测因子。可以预见，随着技术的完善，下一代测序技术检测MRD的性能会越来越好，可为临床治疗提供更早更准确的评估信息。

2.4 基因突变检测 重现性融合基因表达仅出现在较少的AML亚型中，但基因突变是较常见的分子生物学改变，与AML的发生关系密切，是AML危险分层的指标[14,15]。由于技术上的难度，目前临床上以检测核磷蛋白1(NPM1)突变的MRD最为常见。锁核酸(LNA)是一种经过修饰的RNA，其2′和4′的碳连接在一起，因此若在PCR中使用含LNA的引物，反应的稳定性会增加。Shayegi等[16]采用引物中含LNA的实时定量PCR技术检测具有NPM1突变(NPM1mut)AML患者的MRD：依据最大约登指数对应的临界值，NPM1mut/ABL1为1%时具有最佳灵敏度和特异度(首次完全缓解后第90天的监测点)；通过交叉验证部分似然函数推出，化疗后NPM1mut/ABL1>1%最能预测复发，而骨髓移植后NPM1mut/ABL1>10%最能预测复发，并与患者的无病生存率和OS有关，提示使用该方法检测这类患者MRD可为临床的早期干预治疗提供依据。赵婷等[17]研究也表明，NPM1突变阳性的AML患者，伴FLT3-ITD突变和化疗后早期MRD高水平提示预后不良。

3 FCM

白血病相关免疫表型(LAIP)是指正常的外周血和骨髓细胞不表达或表达比例低的免疫表型，主要的LAIP包括异位性抗原表达、跨系表达、跨期表达、抗原表达荧光强度异常、散射光异常等，这是FCM检测MRD的基础和原理。CD304是浆细胞样树突细胞的表面标志，其在B-ALL细胞可出现较强的跨系表达。研究[18]发现，儿童B-ALL患者白血病细胞CD304的阳性表达与短生存率有关，提示CD304表达也许是一种预后不良的因子。CD123在正常造血干细胞为低或不表达，但在白血病细胞上表达增高，且是白血病干细胞的标志之一，AML细胞表达CD34/CD123/CD25/CD99与FLT3-ITD突变密切相关[19]。CD66c是CEA基因家族成员，在血细胞中主要表达于粒细胞，但在BCR/ABL1阳性的B-ALL细胞上也可出现较高表达频率，并对监测MRD具有较高的诊断价值[20]。

随着多色流式细胞仪的发展，FCM检测MRD的准确性和灵敏度均有提高。Weng等[21]利用八色FCM分析了成人B-ALL的MRD：对BCR-ABL阳性的患者，MRD定量采用FCM和实时定量PCR技术，比对分析发现两种方法具有较好一致性(符合率可达到89.7%)；诱导化疗结束时完全缓解及经过1次巩固治疗的患者，若FCM检测MRD阴性(MRD<0.01%)预示着更佳的2年无复发生存率和OS，MRD为0.001%～0.01%的患者较检测不出MRD的患者有较高的2年复发率；多变量分析显示，诱导和1次巩固治疗后MRD阳性(MRD>0.01%)与复发高风险有关，1次巩固治疗后MRD阳性预示较差的OS。八色FCM检测MRD是一种较灵敏的手段，并能评估临床预后，也是FCM检测MRD的一个发展方向。

掌握正常血细胞中不同抗原在不同分化阶段的表达量和表达规律、辨别出AL细胞出现的LAIP类型、确定随访的抗体组合是FCM检测MRD的关键。一项多中心联合利用FCM检测AML MRD研究显示[22]：在学习和培训后的检测阶段，每个中心会有一定程度的LAIP错失，提示LAIP的确定和识别对FCM检测MRD极其关键。另一项5个中心参与的研究结果显示[23]：在欧洲方案的基础上，优选出八色方案检测B-ALL患者的白血病细胞，可以区分出99%患者的异常细胞；与实时定量PCR检测MRD结果比较，两者呈明显的正相关，若能收到足够的细胞，可以达到与实时定量PCR相似的灵敏度。可见利用FCM检测AL MRD需要优化方案并标准化，并加强对检测者的培训。

FCM监测MRD对患者的疗效判断、复发风险评估等有重要作用，并且对移植后的结局预示也非常有价值。Bar等[24]采用FCM监测MRD，发现MRD对ALL患者清髓造血细胞移植的疾病结局有影响：移植前MRD阳性患者具有更高的复发风险；若移植后MRD阳性，患者的复发和死亡风险增加；联合分析移植前后MRD的影响，MRD均阴性患者复发和死亡风险最低，可见FCM对移植AL患者的预后评估提供了有效手段。丁喆等[25]也利用FCM检测成人Ph染色体阴性B-ALL的MRD水平，结果也表明自体造血干细胞移植前和治疗过程中MRD阴性，患者可以获得更好的结局。

4 质谱技术

质谱技术是通过测定样品中被离子化的离子质荷比(m/z)，以实现对样品的定性和定量，是蛋白质组学研究的支撑技术之一。基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)具有较高的灵敏度、精密度，在医学科研中应用较多。Song等[26]利用MALDI-TOF MS分析发现，m/z为4 625的多肽在初治的AL患者中表达高于对照组和非恶性血液病组，并随着治疗后缓解程度的增加而下降；患者获得分子学缓解时，m/z为4 625的多肽峰信号强度与健康对照者相似并明显低于复发患者，且m/z为4 625多肽高水平的患者比低水平患者OS低；可见m/z为4 625的多肽可用于AL患者MRD水平监测和提供预后信息。Bai等[27]利用MALDI-TOF MS获取成人AML患者血清多肽图，发现：快速分类诊断模型寻找出3种敏感性和特异性俱佳的指标，分别为泛素样修饰激活酶1(UBA1)、纤维蛋白原α链前体异构体1和血小板第四因子(PF4)；UBA1水平在初诊、难治性或复发的AML患者中升高，但纤维蛋白原α链前体异构体1和PF4水平在这两者中变化方向与UBA1相反；UBA1表达相对强度高的AML患者生存期较低，纤维蛋白原α链前体异构体1和PF4表达相对强度增高的患者具有较高的OS，由此推测这3种肽能用于MRD检测和临床预后的评估。质谱技术的应用为AL患者检测MRD开辟了新的方向和思路。

新的技术和方法的应用，使AL患者MRD检测更加敏感和准确，但目前也有一些问题有待解决：FISH敏感度低、探针价格昂贵并且应用范围小；PCR技术敏感度高，但融合基因、基因重排或突变并不普遍存在，且分子生物学检测的标准化问题也有待解决；FCM检测优势是适用范围广，但结果受到设门方式、抗体组合的选择、检测者经验等影响，不同实验室间检测结果差异较大，在国内尤其要解决FCM检测的标准化和检验技师的培训问题；质谱技术中复杂的样品前处理、怎样控制检测变异、不同检测平台的数据整合等问题。但随着高通量测序技术、数字PCR技术、芯片技术和蛋白质组学等新技术的发展，越来越多MRD标志物会被发现，将推动AL预后评估进入“MRD时代”。

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