微小核糖核酸在白塞病发病中的作用及其临床应用前景

叶京芬(综述) 管剑龙(审校)

(复旦大学附属华东医院免疫风湿科 上海 200040)

微小核糖核酸在白塞病发病中的作用及其临床应用前景

叶京芬(综述) 管剑龙△(审校)

(复旦大学附属华东医院免疫风湿科 上海 200040)

微小核糖核酸(miRNA)是核糖核酸干扰的内源性介质,通过诱导转录后靶基因表达沉默发挥生物学作用。miRNA对机体免疫细胞具有多种调控功能,参与固有免疫和适应性免疫的调节。异常表达的miRNA通过调节免疫细胞炎性因子参与白塞病(Behcet’s disease,BD)的发病,可能成为BD诊断的标志物和治疗靶点。本文从miRNA调节自身免疫,部分miRNA参与BD发病的机制,miRNA潜在的临床应用价值等进行综述。

微小核糖核酸; 炎性因子; 白塞病

白塞病(Behcet’s disease,BD)是一种慢性、系统性、炎症性疾病,其病理基础是血管炎,可累及全身大小血管[1]。临床上以复发性口腔溃疡、生殖器溃疡、葡萄膜炎和皮肤损害为特征,也可发生消化道溃疡、心脏瓣膜病、静脉血栓、动脉狭窄、动脉瘤、关节炎、血液和神经系统损害。发病机制尚不完全明确,已知感染等环境因素作用于具有遗传倾向的个体,导致免疫细胞炎性因子高表达,参与BD的发病[2-3]。1990年,Napoli等[4]首次发现RNA干扰现象;随后,Fire等[5]提出miRNA是RNA干扰的分子基础。近年来miRNA作为新的生物学分子通过机体内复杂的网络调控体系,参与控制生物体内一系列生物学进程,在BD发病过程中发挥重要作用。本文就BD发病相关的miRNA和miRNA在BD诊断、治疗方面的潜在临床价值进行阐述,为进一步理解BD发病、明确诊断和治疗提供新视角。

miRNA概述 miRNA是长度为19～22个核苷酸组成的非编码RNA,基因转录后其与mRNAs互补结合诱导靶基因降解或抑制靶基因表达而发挥生物学作用。miRNA首先通过RNA聚合酶Ⅱ转录合成含有5’端7甲基鸟嘌呤帽子和3’端多聚核苷酸尾结构的原始miRNA (pri-miRNA),经过Dorsha和DGCR8两个关键酶修饰,最终形成含有茎-环结构的pre-miRNA,随后,pre-miRNA被Exportin5和Dicer引导进入含有Argonaute蛋白的RNA诱导复合体(RNA-induced silencing complex,RISC),结合到RISC的miRNA遵守碱基互补的原则指导RISC降解同源目标mRNA,从而使靶基因沉默[6],进一步影响蛋白质的表达,参与调节免疫细胞产生、分化和炎性因子的表达。研究表明,miRNA通过影响免疫细胞炎性因子表达参与BD发病与进展(图1)[6-12]。

Some miRNAs may be involved in this process by regulating the expression of target mRNAs and its coded protein.Studies showed that increased levels of inflammatory cytokines including IL-1β,IL-17,INF-γ,MCP-1,IL-6 and low level of IL-10 have been linked to altered expression of miRNAs,miRNA-155,miRNA-21,miR-23b and miRNA-196a.

图1 miRNAs通过调节炎性因子表达参与BD发病

Fig 1 miRNAs involved in the pathogenesis of BD by regulating the expression of inflammatory cytokines

miRNA参与固有免疫调节 巨噬细胞(macrophages,mφ)是固有免疫重要的组成部分,根据mφ表面分子不同分为M1型和M2型。动物实验表明,M1、M2型mφ在BD的发病与进展中起作用,疾病活动期主要依靠M1型mφ分泌的炎性因子IFN-γ、IL-6等实现,而在恢复期BD中则表现为M2型mφ标志物Arg1和MHC-Ⅱ表达升高,调节mφ表型可能是一种新的治疗BD方法[13]。众多miRNA在mφ极化中具有调控作用。miRNA-146a可通过抑制靶基因INHBA表达抑制M1型mφ极化、促进M2型mφ极化[14]。相反,miRNA-155则通过靶向下调SOCS1表达,参与并促进mφ炎症应答,miRNA-155过表达显著拮抗地塞米松对TNF-α、IL-6及NO等炎性介质的抑制作用,是糖皮质激素发挥抗炎效果的作用靶点及潜在增敏剂[15]。糖皮质激素是BD常用治疗药物,进一步探索BD炎症应答中相关miRNA的功能,调整内源性miRNA的水平,可能为糖皮质激素耐受BD患者提供新的治疗思路。

miRNA参与适应性免疫调节 初始CD4+T细胞活化诱导基因表达程序变化,进一步分化为Th细胞、CTL细胞和Treg细胞,参与适应性免疫应答和免疫记忆。miRNA的核心蛋白Ago2影响T细胞中miRNA表达,下调T细胞Ago2蛋白和miRNA表达能够促进初始CD4+T细胞向Th细胞分化[16]。Th细胞包括Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞、Treg和Tfh细胞亚群,各亚群受不同miNRA调节,维持Th细胞亚群之间的分化平衡[17];miRNA的异常表达将导致Th细胞亚群功能失调,诱发自身免疫病。Qi等[7]发现,BD患者CD4+T细胞中miRNA-23b表达水平下降,对Th1和Th17扩增具有调控功能;抑制CD4+T细胞中miRNA-23b表达,显著增高Th1、Th17细胞数量及相应细胞因子IFN-γ、IL-17表达。B细胞发挥免疫功能的过程同样受到miRNA等微小分子的调节,Dicer蛋白敲除后的祖B淋巴细胞中miRNA-17～92簇缺乏导致B细胞发育障碍[18]。而在小鼠成熟B淋巴细胞中敲除Dicer蛋白,发现小鼠自身抗体升高[19]。上述研究提示,miRNA在B淋巴细胞发育及免疫调节中发挥作用。正常免疫系统的形成和功能完善需要miRNA参与调节,其表达动态调节免疫细胞分化及成熟免疫细胞发挥免疫功能。相反,miRNA异常表达将导致免疫紊乱、功能异常。

miRNA-23b与BD 早在2002年就有学者提出,Th1细胞是BD的主要致病细胞。近年来发现Th17细胞在BD发病中发挥作用,Th1、Th17分泌释放IL-17、IL-6、IL-21、IL-8、IFN-γ及TNF-α等细胞因子参与BD的发病[3]。其中,Th17表达水平及相应炎性因子IL-17与BD活动密切相关[2]。Notch1信号通路在Th17细胞分化中发挥着关键性作用[8]。Qi等[7]发现,Notch1在活动期BD患者外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)、CD4+T细胞中过度激活,抑制Notch1表达可以减轻Th1、Th17炎性反应;3种miRNAs能够抑制靶蛋白Notch1的,即miRNA-23b、miRNA-21、miRNA-34a,在BD患者CD4+T细胞中进行检测发现,仅miRNA-23b在活动性BD患者CD4+T细胞中低表达;应用miRNA-23b拮抗剂转染CD4+T细胞发现,Notch1信号通路过度活化、STAT3磷酸化水平升高;ELISA法检测Th17相关细胞因子发现,IL-17、IFN-γ表达上调;结果表明,miRNA-23b在CD4+T细胞中低表达与Notch信号通路异常激活相关,通过改变STAT3的磷酸化诱导Th17细胞分化,分泌IL-17、IFN-γ等炎性细胞因子导致BD患者的炎症发生,促进疾病进展。

miRNA-155与BD Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)是固有免疫重要的抗原识别受体,经配体刺激激活后,通过接头分子MyD88 或TRIF 活化下游信号通路,启动免疫反应[20]。TGF-β活性激酶1靶蛋白2(TGF-β-activated kinase 1-binding protein 2,TAB2)是TLR/IL-1信号级联反应的链接蛋白,也是miRNA-155的直接靶点[21]。在成熟树突状细胞中,miRNA-155可通过作用于TAB2下调炎性因子,负反馈调节免疫反应[22]。Zhou等[9]发现miRNA-155在活动期眼BD患者PBMC和未成熟树突状细胞(immature dendritic cell,imDC)中低表达,而Vogt-小柳原田综合征患者与健康对照组相比无差异;通过TargetScan和miRNABase等生物信息工具进一步验证miRNA-155在BD发病中的作用机制,发现miRNA-155能够与TAB2 mRNA的 3’端非翻译区(untranslated region,UTR)互补结合,影响TLR/IL-1信号通路过程中级联反应的靶向蛋白TAB2表达,抑制imDCs分泌IL-6 和IL-1β,促进抗炎因子IL-10表达;结果表明,miRNA-155在BD患者imDCs中低表达,对促炎细胞因子的负向调控减弱而导致BD炎症发生;下调imDC中miRNA-155水平,并将其与CD4+T细胞共培养发现,IL-17表达显著升高;相反,miRNA-155高表达则表现为IL-17表达下调,结果提示,miRNA-155表达下调还可以通过影响imDC对T细胞的调节功能在BD中发挥作用。此外,Na等[10]发现,活动性BD患者CD4+T细胞中miRNA-155高表达,通过抑制Ets-1蛋白表达促使IL-17产生,参与BD发病,上述研究结果表明,miRNA-155在BD中可能同时影响多种炎症通路从而促进疾病发展。

miRNA-146a、miRNA-196a2基因多态性与BD相关 miRNA-146a/rs2910164与BD的发病风险显著相关,在miRNA-146a/rs2910164 CC型BD患者PBMC中,miRNA-146a及IL-17、TNF-α、IL-1β等炎性因子表达显著低于rs2910164 GG型,提示miRNA-146a基因多态性可能通过调控自身miRNA的成熟和炎性因子的表达与BD相关[23]。Qi等[11]发现,pre-miRNA-196a2/rs11614913 TT型人群患BD的发病风险显著升高;进一步研究发现,rs11614913 TT型BD患者PBMC中miRNA-196a表达下调,可能通过靶基因Bach1高表达,IL-1β和MCP-1等炎性因子水平上调与BD相关。miRNA不仅存在于细胞内,而且相对稳定地存在于血液中,这使得其成为生物学标志物的研究具有可行性。因此,进一步研究miRNA-146a、miRNA-196a2及其基因多态性在BD中的作用,将会为临床诊断及治疗提供新的策略。

miRNA作为BD潜在生物学标志物 miRNA不仅具有显著的生物学相关性,还可能成为BD生物学标志物。近来,Erre等[24]采用TaqMan探针进行了基于低密度阵列miRNA表达谱分析,通过对750种人类miRNA研究,探索了5例BD患者和3例健康对照PBMC中miRNA表达谱,与健康人比较,BD患者13种miRNAs表达异常,包括miRNA-571、miRNA-127、miRNA-573、miRNA-770、miRNA-370、miRNA-139-3p、miRNA-720和miRNA-330表达上调,miRNA-200b、miRNA-520c-3p、miRNA-199a-3p、miRNA-224和 miRNA-98表达下调。对miRNA-139-3p和miRNA-720进行实时荧光定量PCR进一步验证显示,BD患者miRNA-139-3p和miRNA-720表达明显上调,但与BD活动性无关,提示miRNA-139-3p和miRNA-720有可能成为BD诊断的标志物。鉴于miRNA免疫调控网络的复杂性和目前检测技术的限制,miRNA作为血液学标志物的临床应用尚待进一步完善。

miRNA作为BD潜在治疗靶点 miRNA在BD患者免疫细胞中存在异常表达,最终通过上调炎性因子水平参与BD的发病,可能有作为BD基因治疗靶点的潜能。Choi等[12]发现,miRNA-21在单纯疱疹病毒诱导的鼠BD模型及BD患者外周血PBMC中高表达。对BD模型鼠分别应用秋水仙碱和己酮可可碱治疗后检测出淋巴结中miRNA-21表达明显下调,其中经过己酮可可碱治疗的BD鼠皮肤症状有所改善;进一步应用miRNA-21拮抗剂验证体内效应发现,miRNA-21的靶基因PDCD4、RhoB、PD-1和IL-12p35在具有miRNA-21拮抗效应的PBMC中高表达,通过下调相应炎性因子IL-17和IL-6水平,改善BD鼠症状和评分。结果提示,BD患者PBMC中高表达的miRNA-21可能通过抑制靶基因表达上调IL-17和IL-6参与BD炎症,miRNA-21拮抗剂对单纯疱疹病毒诱导的鼠BD模型的治疗是有效的,该研究成果为BD的治疗提供了新的切入点。

结语 至今靶向miRNAs的药物尚未从实验室向临床应用过渡,在这之前探索与BD密切相关的miRNAs及其作用机制,全面了解miRNAs在BD中特异性靶基因、靶蛋白及信号转导通路将有助于进一步了解BD的发病机制,为BD的预防、治疗及判断预后等临床实践提供理论基础。

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The pathgenetic role and potential clinical application of miRNAs in patients with Behcet’s disease

YE Jing-fen, GUAN Jian-long△

(DepartmentofImmunologyandRheumatology,HuadongHospital,FudanUniversity,Shanghai200040,China)

As the endogenous mediators of RNA interference,miRNA play biological roles by inducing post-transcriptional silence of gene expression.Previous studies showed that miRNAs have multiple regulating potential to immune cells,involved in regulation of innate and adaptive immunity.Recently,aberrant expression of miRNAs have been confirmed to be relevant to the pathogenesis of Behcet’s disease (BD) by regulating the expression of inflammatory cytokines in immune cells,which may become of its diagnostic marker and therapeutic target in the future.In this review,we discuss how miRNAs regulate autoimmunity.Several miRNAs associate with the pathogenesis of BD,thus they have the potential clinical application value.

miRNA; inflammatory cytokines; Behcet’s disease

R593.1

B

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.04.026

2016-08-22;编辑:段佳)

上海卫生系统第二批重要疾病联合攻关重点项目(2014ZYJB0010)

△Corresponding author E-mail:guanjianlong@medmail.com.cn

*This work was supported by Shanghai Health System Key Joint Research Project on Important Diseases of the Second Batch (2014ZYJB0010).