粉末活性炭联合盐析法纯化藻蓝蛋白的研究

盛晶梦, 张发宇, 袁梦媛, 汪家权

(合肥工业大学 资源与环境工程学院,安徽 合肥 230009)

粉末活性炭联合盐析法纯化藻蓝蛋白的研究

盛晶梦, 张发宇, 袁梦媛, 汪家权

(合肥工业大学 资源与环境工程学院,安徽 合肥 230009)

文章以巢湖新鲜蓝藻藻泥为处理材料,采取粉末活性炭联合盐析的方法提取纯化藻蓝蛋白。综合考虑粉末活性炭种类、粒径、添加量、处理时间、pH值及硫酸铵浓度等影响因素,通过一系列单因素试验研究了不同活性炭处理条件以及两步盐析中硫酸铵的浓度对藻蓝蛋白提纯的影响,对藻蓝蛋白的提纯条件进行了优化。结果表明:在粉末活性炭种类为煤质,粒径为400～500目,添加量为100 g/L,静置时间为10 min,pH值为7.0,两步盐析(NH4)2SO4的浓度分别为1 mol/L和2 mol/L时,粉末活性炭联合盐析法提纯藻蓝蛋白的效果最好,藻蓝蛋白的纯度可达3.16,回收率为45%。

粉末活性炭;两步盐析;提取纯化;藻蓝蛋白

我国是世界上多湖泊国家,湖泊富营养化已经成为我国最重要的水环境问题之一。为控制并消除巢湖蓝藻污染,一方面,系统全面的巢湖水华预警监控方案得到长足研究[1];另一方面,在每年的水华蓝藻暴发季有大量蓝藻被打捞上来。与此同时,打捞上来的蓝藻资源化利用也成为巢湖蓝藻重点研究的课题[2]之一。目前国内外有关水华蓝藻资源化利用的研究主要集中在堆肥处理和蓝藻中有效物质提取2个方面。近年来,利用蓝藻生产高附加值产品蓝蛋白成为研究重点。研究表明,藻蓝蛋白具有抗氧化性[3-4]、抗癌性[5]、免疫荧光性[6-7]等功效。藻蓝蛋白纯度的高低决定了其应用和价值,纯度越高,售价越高,根据藻蓝蛋白纯度的不同可将其分为食品级(纯度>0.7)和试剂级(纯度>4.0)[8]。因此,从水华蓝藻中提取纯化较高纯度的藻蓝蛋白,既可实现水华蓝藻的无害化,又可实现其资源化。

有关提取纯化藻蓝蛋白方法的研究有很多[9-12],其中盐析法作为常见的方法,多被单独使用[13]或与双水相[14]、柱层析[15]等方法联合使用以纯化藻蓝蛋白。现有的藻蓝蛋白提取纯化技术多应用于实验室阶段,在推广到规模化应用时常会遇到来自产品纯度、得率和成本的挑战[16]。因此,工艺代替、不同提纯方法组合应用成为新的热点,许多新的提纯技术也涌现出来。

活性炭常作为水处理中去除色、嗅、味和有机物的有效方法之一[17],近些年也有人研究活性炭对藻毒素的去除效果[18]。有关活性炭及与其他方法联合应用纯化藻蓝蛋白的研究却很少。文献[19]向粗提中液加入2%的壳聚糖充分搅拌后离心,再向上清液中加入适量活性炭离心取上清,藻蓝蛋白的纯度由0.93提升至2.78。本文通过试验,对粉末活性炭的种类、粒径、添加量、处理时间及pH值等条件进行了研究,确定了粉末活性炭联合两步盐析法纯化藻蓝蛋白的效果,优化了处理条件。与传统多步盐析法及其联合方法相比,本研究方法引入杂质少、操作简单、设备成本低、材料可回收利用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

粗提液的制备原料采用实验室冷柜中储存的巢湖新鲜蓝藻藻泥,取自西湖区水华表层20 cm水体处,含水量约为96.2%,采集日期为2015年8月4日,室外气温为37～38 ℃。

常用试剂:(NH4)2SO4、活性炭、HCl、NaOH、浓度为0.002 5 mol/L的PBS缓冲液、冰醋酸、甲醇、丙烯酰胺、甘油、十二烷基硫酸钠、考马斯亮蓝R-250、甘氨酸、溴酚蓝。

1.2 分析方法

藻蓝蛋白在620 nm处有特征吸收峰,蛋白在280 nm处有最大吸收峰。将藻蓝蛋白溶液在200～700 nm范围内进行紫外-可见光光谱扫描,藻蓝蛋白的纯度[20]、质量浓度[21]及其回收率计算公式分别为：

其中,A280、A620分别为波长280、620 nm处的吸光度;ρt为样品溶液中的藻蓝蛋白质量浓度;ρ0为粗提液中的藻蓝蛋白质量浓度;Vt为样品溶液的体积;V0为粗提液的体积。

1.3 藻蓝蛋白粗提液的制备

取冷冻保存的巢湖新鲜蓝藻藻泥,反复冻融3次。将解冻后的蓝藻溶液用4层普通纱布过滤去除藻渣,上清液于4 ℃、8 000 r/min条件下离心20 min,即可得到藻蓝蛋白粗提液。

1.4 粉末活性炭处理单因素试验

水中有机物组分复杂,以表征单一物质的活性炭吸附性能参数无法很好地反映对水中有机物的吸附效果,而且现行的商品粉末活性炭常用的吸附性能参数(碘值、亚甲基兰值)与有机物去除量之间没有显著相关性[22]。因此,本试验以藻蓝蛋白纯度和回收率为参考指标,来选择适合于藻蓝蛋白粗提液预处理的粉末活性炭种类与条件。

1.4.1 粉末活性炭种类

室温下,分别取市售的煤质、木质、果壳粉末活性炭各1 g于20 mL藻蓝蛋白粗提液中充分搅拌5 min,抽滤后测定藻蓝蛋白纯度,计算回收率,研究粉末活性炭种类对藻蓝蛋白提纯的影响。

1.4.2 粉末活性炭粒径

将市售煤质活性炭粉末湿法过筛,用100、200、300、400、500目分子筛过滤后在80 ℃下烘干24 h,获得不同粒径煤质活性炭粉末。室温下,在煤质粉末活性炭添加量为100 g/L,pH值为6.0的条件下,分别将不同粒径的煤质粉末活性炭与粗提液充分搅拌5 min,抽滤后测定藻蓝蛋白纯度,并计算回收率。

1.4.3 粉末活性炭添加量

室温下,在pH值为6.0,煤质粉末活性炭粒径为400～500目的条件下,取适量粉末活性炭于粗提液中充分搅拌5 min,使粗提液中活性炭质量浓度分别为50、100、150、200、250 g/L,抽滤后测定藻蓝蛋白纯度,计算回收率。

1.4.4 处理时间

室温下,在pH值为6.0,煤质粉末活性炭粒径为400～500目,添加量为100 g/L的条件下,将粉末活性炭与粗提液充分搅拌,处理时间分别为0、5、10、15、20 min,然后抽滤,测定藻蓝蛋白纯度,计算回收率。

1.4.5 pH值

室温下,在煤质粉末活性炭粒径为400～500目,添加量为100 g/L,搅拌时间10 min的条件下,分别在pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的条件下处理,抽滤后测定藻蓝蛋白纯度,计算回收率。

1.5 盐析单因素实验

1.5.1 一步(NH4)2SO4盐析

将粗提液在粉末活性炭种类为煤质,粒径为400～500目,添加量为100 g/L,pH值为7.0,搅拌时间为10 min的条件下纯化后,进行一步盐析。向粉末活性炭纯化后的藻蓝蛋白溶液中加入适量(NH4)2SO4,将浓度分别调节至0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mol/L。充分搅拌溶解后将粗提液于4 ℃、8 000 r/min条件下离心20 min,获取上清液,测定上清液中藻蓝蛋白的纯度和回收率。

1.5.2 两步(NH4)2SO4盐析

在一步盐析的基础上,进行两步盐析。将粉末活性炭最优条件纯化过的藻蓝蛋白溶液经一次盐析,硫酸铵浓度为1.0 mol/L,离心取上清液备用。分别向备用液中缓慢加入硫酸铵使其浓度为1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4 mol/L,待硫酸铵充分溶解后将溶液于4 ℃、8 000 r/min条件下离心20 min,取沉淀,用磷酸缓冲溶液(0.002 5 mol/L)溶解后测定溶液中藻蓝蛋白纯度和回收率。

1.6 成品分析

“秦月”由“秦富1号”和“嘎拉”杂交育成。果实呈圆形或长圆锥形，大小均匀，果个与嘎拉接近，果皮鲜红，果肉黄白，肉质细脆多汁，酸甜适口，较耐贮存。在渭北高原南部地区8月底成熟，渭北高原中部地区9月上中旬成熟，刚好赶上中秋节和国庆节，是一个优良的中熟苹果新品种。

1.6.1 纯化后藻蓝蛋白的光谱特性

经粉末活性炭种类为煤质,粒径为400～500目,添加量为100 g/L,pH值为7.0,搅拌时间为10 min处理后的藻蓝蛋白溶液和两步盐析(两步盐析(NH4)2SO4最佳浓度分别为1 mol/L和2 mol/L)后的藻蓝蛋白溶液在200～700 nm范围内进行紫外-可见光光谱扫描。

1.6.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定

聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)分离胶为15%,浓缩胶为5%。配制适量的电泳缓冲液、0.1%的考马斯亮蓝R-250染色液、10%甲醇与10%冰醋酸(体积比为1∶1)组成的脱色液。将电极接好,接通电源,对经粉末活性炭联合两步盐析法纯化(粉末活性炭种类为煤质,粒径为400～500目,添加量为100 g/L,pH值为7.0,搅拌时间为10 min,两步盐析(NH4)2SO4最佳浓度分别为1 mol/L和2 mol/L)后的纯度为3.16的藻蓝蛋白样品进行PAGE测定,等指示剂迁移至距凝胶下端1 cm处时停止电泳。取出凝胶并浸泡于考马斯亮蓝染色液中,染色1 h。然后用脱色液脱色,更换几次脱色液至背景无色。

2 结果与讨论

2.1 粉末活性炭处理单因素试验结果

2.1.1 粉末活性炭种类的影响

表1 粉末活性炭种类对藻蓝蛋白纯度和回收率的影响

注:粗提液藻蓝蛋白纯度为0.51。

由表1可知,不同种类的活性炭对粗提液均有纯化效果,这可能是由于活性炭主要吸附分子量为500～3 000内的小分子有机物[23],如藻毒素、嗅味物质、叶绿素、杂蛋白等,从而起到纯化藻蓝蛋白的效果。煤质粉末活性炭对藻蓝蛋白有显著的纯化效果,粗提液纯度由0.51增长至1.63,藻蓝蛋白的回收率达到60%;而椰壳粉末活性炭对藻蓝蛋白的纯化效果最差、回收率较低;木质活性炭对藻蓝蛋白的纯化效果适中,藻蓝蛋白的回收率最低,只有22%。这可能是由于相对于煤质活性炭,木质活性炭中孔容积较大,更容易吸附藻蓝蛋白,使得回收率很低;椰壳活性炭的孔隙尺寸与藻蓝蛋白相近,容易发生阻塞从而阻碍了小分子杂质进入微孔,藻蓝蛋白的纯度和回收率均较低。综合考虑藻蓝蛋白的纯度与回收率,后续实验选择煤质粉末状活性炭。

2.1.2 粉末活性炭粒径的影响

不同粒径的煤质粉末活性炭对藻蓝蛋白纯度和回收率的影响如图1所示。

由图1可看出,随着煤质粉末活性炭粒径的减小,活性炭的比表面积增大,中、微孔数量增多,对小分子有机物的吸附性增强[24],使得藻蓝蛋白纯度增长较快;随着活性炭粒径的继续减小,活性炭粉末对藻蓝蛋白的吸附性明显大于对杂质的吸附性,藻蓝蛋白纯度开始降低。当粉末活性炭粒径范围为200～300目时,藻蓝蛋白的回收率达到最大值;之后随着活性炭粒径的减小,活性炭微孔更容易暴露在溶液中,对藻蓝蛋白和杂质的吸附性大大增强,藻蓝蛋白的回收率迅速降低。因此,综合考虑纯度和回收率,煤质粉末活性炭的粒径定为400～500目。

图1 粉末活性炭粒径对藻蓝蛋白纯度和回收率的影响

2.1.3 粉末活性炭添加量的影响

不同煤质粉末活性炭添加量对藻蓝蛋白纯度和回收率的影响如图2所示。

图2 粉末活性炭添加量对藻蓝蛋白纯度和回收率的影响

由图2可知,在其他条件不变的情况下,随着粉末活性炭添加量的增加,藻蓝蛋白纯度增长较快;当添加量高于150 g/L时,藻蓝蛋白纯度缓慢下降。藻蓝蛋白的回收率则随着粉末活性炭添加量的增加而迅速下降。这可能是由于随着活性炭添加量的增加,溶液中活性炭的比表面积增大,中孔容积增大,对藻蓝蛋白的吸附性增强,导致对藻蓝蛋白的吸附量逐渐大于对杂蛋白的吸附量;同时藻蓝蛋白阻塞了孔隙，阻碍了对小分子杂蛋白的吸附，使得藻蓝蛋白的纯度先增后减,在150 g/L时纯度最高,为1.81,而回收率则迅速下降。因此,综合考虑纯度和回收率,粉末活性炭的添加量定为100 g/L。

2.1.4 处理时间的影响

不同的煤质粉末活性炭处理时间对藻蓝蛋白纯度和回收率的影响如图3所示。

图3 处理时间对藻蓝蛋白纯度和回收率的影响

由图3可知,在其他条件不变的情况下,随着煤质粉末活性炭处理时间的增加,藻蓝蛋白的纯度缓慢增长。而当处理时间为0～10 min时,藻蓝蛋白的回收率下降较慢;当搅拌时间为10～20 min时,藻蓝蛋白的回收率下降较快。这可能是由于活性炭对小分子有机物的吸附主要发生在刚接触阶段,之后随着接触时间的增加,活性炭对杂质的吸附量增长缓慢,对藻蓝蛋白的不可逆吸附则逐渐增加,使得回收率下降较快。因此,综合考虑藻蓝蛋白的纯度和回收率,处理时间定为10 min。

2.1.5 pH值的影响

pH值对藻蓝蛋白纯度和回收率的影响如图4所示。

图4 pH值对藻蓝蛋白纯度和回收率的影响

由图4可知,在其他条件不变的情况下,随着pH值的增长,藻蓝蛋白的纯度和回收率都呈现先增加后减少的趋势,在pH值为7.0时达到最大,分别为1.70和50%。这可能是由于藻蓝蛋白溶液的pH值靠近7.0,溶液呈极酸或极碱状态时,藻蓝蛋白大部分失活,从而被活性炭较多吸附。因此,综合考虑藻蓝蛋白的纯度和回收率,pH值定为7.0。

2.2 盐析单因素试验

2.2.1 一步(NH4)2SO4盐析

经过粉末活性炭处理后,获得纯度为1.70的藻蓝蛋白,采用一步(NH4)2SO4盐析进行试验,测定溶液中藻蓝蛋白纯度和回收率如图5所示。

图5 一步盐析(NH4)2SO4浓度对纯度和回收率的影响

由图5可知,随着硫酸铵浓度不断增加,藻蓝蛋白纯度先缓慢增加后下降较快,在1 mol/L时达到最大值，而随着硫酸铵浓度不断增加,藻蓝蛋白的回收率缓慢下降。这可能由于随着硫酸铵浓度的增加,除了杂质,部分藻蓝蛋白也被沉淀了出来。因此,综合考虑藻蓝蛋白的纯度和回收率,一步盐析硫酸铵的最佳浓度为1 mol/L。

2.2.2 两步(NH4)2SO4盐析

进行两步(NH4)2SO4盐析试验,测定溶液中藻蓝蛋白纯度和回收率,如图6所示。

图6 两步盐析(NH4)2SO4浓度对纯度和回收率的影响

由图6可知,当硫酸铵浓度为1.4 mol/L时,溶液中的藻蓝蛋白无法沉淀析出。当硫酸铵浓度为1.6～2.4 mol/L时,随着硫酸铵浓度不断增加,藻蓝蛋白的纯度先增加后降低,在1.8 mol/L处达到最大值3.19,藻蓝蛋白的回收率则先增加后维持不变。这可能是由于硫酸铵浓度过高时,部分藻蓝蛋白失活,且杂质也被从溶液中沉淀了下来,使得藻蓝蛋白的纯度先增加后不变，而回收率迅速下降。因此综合考虑藻蓝蛋白的纯度和回收率,两步盐析硫酸铵的最佳浓度为2 mol/L,此时藻蓝蛋白的纯度可达3.16,回收率为45%。

2.3 成品分析

2.3.1 纯化后藻蓝蛋白的光谱特性

将藻蓝蛋白溶液进行紫外-可见光光谱扫描,光谱图如图7所示。

图7 纯化后藻蓝蛋白紫外-可见吸收光谱图

由图7可知,藻蓝蛋白粗提液在620 nm处有特征吸收峰。经粉末活性炭预处理后,藻蓝蛋白溶液在280 nm处吸光度下降幅度最大,约减少了87%;在620 nm处的吸光度减少了约52%,藻蓝蛋白粗提液纯度大幅增加,纯度为1.70。这从侧面验证了粉末活性炭对于杂质蛋白的优先吸附性。经过两步盐析处理,蓝藻溶液在280 nm处的吸光度继续下降,而在620 nm处吸光度几乎不变,说明两步盐析后藻蓝蛋白粗提液中的杂质得到了进一步去除,而藻蓝蛋白得以大部分保留下来。

2.3.2 PAGE鉴定

藻蓝蛋白的PAGE结果如图8所示。

图8 藻蓝蛋白的PAGE图

经煤质粉末活性炭联合两步盐析提纯后的藻蓝蛋白纯度达到3.16,经电泳后形成了2条相邻的平行谱带,这表明此种藻蓝蛋白是由α、β大小2个亚基组成的,分子量分别为18 kDa和20 kDa,与文献[25]说明相符。

3 结 论

文献[14]用粗提液进行四步盐析(硫酸铵饱和度分别为25%、55%、5%、35%)后藻蓝蛋白纯度由0.6升至2.52,回收率为63.5%。本文工艺操作简单,两步盐析阶段无需静置12 h;粗提液纯度由0.51上升至3.16,增幅更大;两步盐析最佳硫酸铵浓度分别为1 mol/L和2 mol/L,用硫酸铵饱和度表示分别为23%和43%,比文献[14]粗提液前2步盐析,所需的硫酸铵分别减少了3%和12%。以上结果表明粉末活性炭和盐析的纯化效果可叠加,进一步去除粗提液中的杂蛋白和小分子物质,且比单纯盐析方法的纯化效果更好、所需试剂量更少。同时,活性炭粉末的重新回收利用也有待进一步研究。

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(责任编辑 闫杏丽)

Study of extraction and purification of C-phycocyanin from blue algae by combined use of powdered activated carbon treatment and salt precipitation

SHENG Jingmeng, ZHANG Fayu, YUAN Mengyuan, WANG Jiaquan

(School of Resources and Environmental Engineering， Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

The extraction and purification of C-phycocyanin from fresh blue algae in Chaohu Lake were performed by the combined use of powdered activated carbon(PAC) treatment and salt precipitation. Considering the PAC variety， particle size， dosage， treatment time， pH value and amount of substance concentration of (NH4)2SO4， the effects of different PAC treatment conditions and amount of substance concentration of (NH4)2SO4in two-step salt precipitation on the extraction and purification of C-phycocyanin were studied by series of single factor experiments，and the extraction and purification conditions were optimized. The results showed that the effect of combined use of PAC and salt precipitation was best when the coal PAC particle size was 400-500 mesh， dosage was 100 g/L， treatment time was 10 min, pH value was 7.0 and the amount of substance concentration of (NH4)2SO4in two-step salt precipitation were 1 mol/L and 2 mol/L， and the purity and recovery rate of C-phycocyanin were 3.16 and 45%.

powdered activated carbon(PAC); two-step salt precipitation; extraction and purification; C-phycocyanin

2015-12-31；

2016-03-17

国家“十二五”科技重大专项资助项目(2012ZX07103-004)

盛晶梦(1991-),女,安徽淮南人,合肥工业大学硕士生; 汪家权(1957-),男,安徽安庆人,合肥工业大学教授,博士生导师.

10.3969/j.issn.1003-5060.2017.02.020

TQ464.7

A

1003-5060(2017)02-0242-06