谢玲林
[摘要] 目的 探讨SIRT6基因沉默对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。方法 构建肝癌细胞系,转染SIRT6,检测SIRT6 mRNA及蛋白质的表达水平;将表达shSIRT6的慢病毒感染Huh-7细胞,培养后检测SIRT6 mRNA、蛋白质表达水平及凋亡情况。结果 成功构建了沉默SIRT6基因的Huh-7稳定细胞系,在Huh-7细胞中,mRNA表达的抑制率达81.25%,其SIRT6蛋白质水平亦受到抑制;Huh-7细胞的凋亡比例为(16.52±2.08)%。 结论 SIRT6基因沉默可诱导人肝癌细胞凋亡,进而抑制其增殖。
[关键词] 肝细胞癌;SIRT6;增殖;凋亡
[中图分类号] R735 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742(2017)01(c)-0054-03
Effect of SIRT6 Gene Silencing on the Proliferation and Apoptosis of Liver Cancer Cells
XIE Ling-lin
Microbiology Teaching and Research Room, Sichuan Nursing Vocational College, Chengdu, Sichuan Province, 610100 China
[Abstract] Objective To discuss the effect of SIRT6 gene silencing on the proliferation?and?apoptosis of liver cancer cells. Methods The SMMC-7721 was constructed and transfected with SIRT6, and SIRT6 mRNA and protein expression levels were tested, and SIRT6 mRNA, protein expression level and apoptosis were tested after culturing the slow-virus infection Huh-7 cells expressing shSIRT6. Results Huh-7 stable cell line of the silencing SIRT6 gene was successfully constructed, in the Huh-7 cells, the inhabitation rate of mRNA expression reached 81.25%, and the SIRT6 protein level was also inhabited, and the apoptosis ratio of Huh-7 cells reached (16.52±2.08)%. Conclusion SIRT6 gene silencing can induce the apoptosis of human hepatoma cells thus inhabiting the proliferation.
[Key words] Hepatocellular carcinoma; SIRT6; Proliferation;Apoptosis
肝细胞癌作为临床上常见的恶性肿瘤,其患病率及病死率一直居高不下,手术是常用的治疗手段,但效果常不尽如人意。探索肝细胞癌的发生发展的内在机制,寻求有效抑制癌细胞增生的新疗法一直是临床研究的重要课题。Sirtuins是存在于哺乳动物基因中的酵母沉默信息调节因子的同源基因,其中,沉默信息调节因子6(silent information regulator 6,SIRT6)具有抗癌作用,而当SIRT6缺失时,细胞则会出现组蛋白H3第56位赖氨酸(histone H3 on lysine 56,H3K56)高度乙酰化,而这是与肿瘤息息相关的一类染色质修饰。此外SIRT6对基因组的稳定性、炎性反应等都有调节作用,这也是其发挥抑癌作用的一个重要方面[1]。该研究以2015年1月—2016年1月来四川护理职业学院附属医院就诊的88例肝癌患者的细胞系为研究对象,旨在探讨SIRT6对肝癌细胞增殖和凋亡的影响,并分析其内在机制,以期为肝癌的临床治疗提供新的思路,现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
88例人肝癌细胞系SK-Hep-1、PLC/PRF/5、HepG2、Huh-7均来自2015年1月—2016年1月来四川护理职业学院附属医院就诊的肝癌患者;永生化肝细胞系MIHA购自上海冠导生物工程有限公司;pCMV6-XL5和pCMV6-XL5-XIAP质粒购自Cell Biolabs公司;shSIRT6慢病毒购自GeneChem公司;SIRT6抗体购自Sigma公司;羊抗鼠IgG-HRP和GAPDH抗体购自上海市雅吉生物科技有限公司;羊抗兔IgG-HRP购自北京博尔西科技有限公司;质粒转染试剂购自Roche公司;siRNA转染试剂Lipofectamine 2000购自上海联硕生物科技有限公司;Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自南昌乐悠生物科技有限公司;培养基购自Gibco公司;RT-PCR试剂盒购自TAKARA公司。
1.2 细胞培养
在5%CO2,37℃的恒温箱中分别对SK-Hep-1、PLC/PRF/5、HepG2、Huh-7 4個细胞系进行培养,并按说明书进行质粒转染及siRNA转染。
1.3 Western blot
收集细胞,洗涤后加入裂解液,离心取上清液,电泳分离蛋白质,转膜后用TBST洗膜,加入包被液,平稳摇动,室温2hr,继续洗膜,加入一抗,4℃放置12hr以上,弃一抗,TBST洗膜,二抗室温2hr,TBST洗膜,加入显色液,避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。阴性对照以β-actin作为内参,其余步骤与实验组相同。
1.4 RT-PCR检测
裂解细胞提取RNA,逆转录为cDNA,利用试剂盒进行RT-PCR,以β-actin为内参,每组实验重复3次。
1.5 流式细胞术检测细胞凋亡
SK-Hep-1和Huh-7细胞转染72 h后,洗涤并离心,加入195 μL Annexin-V结合液重悬细胞、6μL Annexin-V、4 μL PI,室温避光孵育20 min,立即进行流式细胞术进行检测。
1.6 统计方法
采用SPSS 20.0统计学软件进行统计分析数据,两组间比较采用配对t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 SIRT6在肝癌细胞系中的表达
经RT-PCR和Western blot结果显示,SIRT6在4个肝癌细胞系中的mRNA和蛋白质水平较永生化肝细胞系MIHA明显升高,见图1、2。
2.2 慢病毒介导的shRNA对SIRT6的抑制作用
将表达shSIRT6的慢病毒感染Huh-7细胞,构建SIRT6-shRNA-Huh-7稳定细胞系,并采用RT-PCR和Western blot检测SIRT6 mRNA及蛋白质水平。结果表明,在Huh-7细胞中,mRNA表达的抑制率达81.25%;应用Western blot检测Huh-7细胞中SIRT6蛋白质水平,结果显示,其SIRT6蛋白质水平亦受到抑制。
2.3 SIRT6基因沉默可诱导人肝癌细胞凋亡
对感染慢病毒后的Huh-7细胞进行流式细胞术检测。结果显示,Huh-7细胞的凋亡比例为(16.52±2.08)%,提示SIRT6基因沉默可诱导人肝癌细胞凋亡。
3 讨论
随着分子生物学的发展,基因在临床中的应用及潜在价值越来越受到医务工作者的重视[2]。SIRT6是Sirtuin家族的重要成员,最早在酵母等低等生物中发现,随后陆续在高等生物的基因中发现其同源序列。哺乳动物的Sirtuin家族包括7个成员,其中SIRT6在抗衰老及抗癌方面有着重要作用[3]。葡萄糖代谢在肿瘤细胞的生长、增殖中占据重要地位,SIRT6可通过调控胰岛素的信号转导来干预葡萄糖的代谢,进而影响肿瘤细胞的增殖和凋亡[4]。除此之外,SIRT6还可参与基因的损伤修复,在维护正常基因序列的同时,对异变的肿瘤基因起到抑制、杀灭的作用[5]。
关于SIRT6在抗癌中的作用,既往有多位学者做了深入研究。该研究成功构建了沉默SIRT6基因的Huh-7稳定细胞系,在Huh-7细胞中,mRNA表达的抑制率达81.25%,其SIRT6蛋白质水平亦受到抑制;Huh-7细胞的凋亡比例为(16.52±2.08)%。提示SIRT6基因沉默对于肝癌细胞的凋亡有促进作用,这与既往相关学者的研究结果相一致。周洪钟等[6]将表达shSIRT6-1、shSIRT6-2的慢病毒分别感染SK-Hep-1和Huh-7细胞,结果显示,SK-Hep-1细胞中shSIRT6-1和shSIRT6-2组的细胞凋亡比例分别为(20.5±2.64)%和(18.4±2.1)%;Huh-7细胞中shSIRT6-1和shSIRT6-2組的细胞凋亡比例分别为(17.4±2)%和(21.93±2.45)%,提示SIRT6基因沉默可诱导人肝癌细胞凋亡。SIRT6可通过p53、p73和ATM信号通路及影响ADP-核糖基转移酶活性促进肿瘤细胞的凋亡。但亦有学者提出不同观点,刘妙娜等[7]的研究证实,SIRT6在HepG2肝癌细胞株过度表达具有较为明显的抗肿瘤作用,该作用在诱导细胞凋亡的基础上,抑制ERK1/2信号通路。同时,SIRT6过度表达能够降低HepG2肝癌细胞ROS水平[8-9]。因而在关于SIRT6的具体抗癌机制及临床应用方面还需进一步探索。
4 结语
SIRT6基因沉默在促进肝癌细胞凋亡,抑制其增殖方面效果显著。但是,其具体的作用机制尚未研究透彻,操作手段目前发展尚不成熟,有待于进一步深入研究。此外,关于SIRT6在肿瘤治疗中的具体作用尚有争议,其双重作用可能有组织、因子分布乃至肿瘤分型及发展阶段等息息相关,这些都需要科研人员及临床工作者的进一步探索。
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[6] 周洪钟,陶娜娜,陈祥,等.SIRT6基因沉默对人肝癌细胞凋亡的影响及其机制研究[J].中国细胞生物学学报,2016,38(4):389-396.
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