新支减流四联灭活疫苗最小免疫剂量确定及免疫效果评价

崔艳丽/黑龙江省兽药饲料监察所

新支减流四联灭活疫苗最小免疫剂量确定及免疫效果评价

崔艳丽/黑龙江省兽药饲料监察所

鸡新城疫（ND）、鸡传染性支气管炎（IB）、鸡减蛋综合征（EDS）和禽流感（AI）是危害养禽业最主要的传染病，具有高致病力和高死亡率特点，造成严重的经济损失，现在针对新型疫苗毒株不断出现，在养殖实际中需要科学的免疫程序，以便充分发挥新疫苗的免疫效力。哈药集团生物疫苗有限公司(以下简称哈药疫苗)推出了鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感（H9亚型）四联灭活疫苗（La Sota株+M41株+HS25株+HZ株）四联灭活苗，为验证该疫苗的实际免疫效果并制定科学的免疫程序，并通过血凝抑制试验(HI)和攻毒保护试验对疫苗的免疫效果进行了评价。结果显示，四联灭活疫苗具有很好的免疫效力，均达到我国、发达国家和国际组织的标准。随机抽取试验鸡，进行攻毒试验，100%保护。四联灭活疫苗最小免疫剂量为 62．5ul，正常接种剂量（0．5ml）含8个最小免疫剂量。为进一步证实该产品在实际生产中的防控作用，实施如下试验，希望能够对广大养殖业者的防控提供实验数据。

一、材料与方法

1.材料。

（1）试验用四联灭活疫苗。

疫苗：ND-IB-EDS76-AI（H9）四联灭活苗由哈药集团生物疫苗有限公司生产，批号：201601

种毒：NDV La Sota株、IBV M41株、ND强毒CVCC AV1611株购于中国兽医药品监察所。

AIV HZ株、EDSV HS25株由东北农业大学分离鉴定，哈药集团生物疫苗有限公司保存和供应。

（2）检测用血凝抗原和抗血。

NDV抗原和抗血清由本实验室制备，HA抗原效价≥1∶512；抗血清HI≥1∶256。

IBV(M41株)抗原和抗血清IBV（M41株）HA抗原购自荷兰GD公司。抗血清由实验室自制，小量分装，-70℃保存，HI≥1∶256。

EDS76V(HS25株)抗原和抗血清由实验室制备，HA抗原效价≥1∶10240；抗血清HI≥1∶256。

AIV(HZ株)抗原和抗血清由实验室制备，HA抗原效价≥1∶256；抗血清HI≥1∶256。

（3）试验用动物。

SPF鸡：从山东农科院购买SPF鸡胚，自行孵化，在相对隔离的环境中饲养。

商品蛋鸡：从哈尔滨市市郊某鸡场购买，并隔离饲养。

2.主要仪器。

3.试验方法。

（1）免疫效力试验。

①四联灭活疫苗ND部分免疫效力试验：用28日龄SPF鸡15只，其中10只各皮下注射疫苗20μl（1/25羽份），另5只作对照。接种后21日，每只鸡采血，分离血清，进行HI抗体效价测定。

②四联灭活疫苗IB(M41株)部分免疫效力试验：用14日龄SPF鸡10只，各点眼接种鸡传染性支气管炎活疫苗（H120）1羽份。接种后21日，分别采血，同时各皮下注射灭活疫苗0．5m1，注射后21日，再分别采血，分离血清。分别测定两次血清HI抗体效价。

③四联灭活疫苗EDS(HS25株)部分免疫效力试验：用21日龄SPF鸡15只，其中10只经颈部接种灭活疫苗0．5mL，另5只不接种，作对照。注射后21日，分别采血，分离血清，检测抗EDS76V的HI抗体。

④四联灭活疫苗AI(H9)部分免疫效力试验：用21日龄SPF鸡15只，其中10只各皮下注射疫苗0．3ml，另5只作对照。接种后21日，每只鸡采血，分离血清，进行HI抗体效价测定。同时，各静脉注射H9亚型禽流感病毒HZ株0．2ml（≥107．0EID50），攻毒后第5日，采集每只鸡的泄殖腔拭子进行病毒分离。将每只鸡的样品经尿囊腔内接种9～11日龄SPF鸡胚5枚。孵育观察5日，无论死胚、活胚均应测定鸡胚液血凝价，以5枚鸡胚中至少有1枚鸡胚的鸡胚液血凝价不低于1：16（微量法）判为病毒分离阳性。对病毒分离为阴性的样品，应盲传1次，再次测定HA价。

（2）最小免疫剂量确定。用生理盐水为水相，与油相按1∶2的比例混合，乳化，制成疫苗稀释剂。疫苗稀释剂与疫苗按照1∶3、1∶7、1∶15的比例，将疫苗稀释至原来的1/4、1/8、1/16。用320只100日龄蛋鸡。

鸡平均分成2组，第一组为对照组，160只，不免疫。另一组为免疫组，160只，在100日龄时，每只鸡滴鼻接种传染性支气管炎活疫苗（H120株），1羽份/只。免后30日即蛋鸡130日龄时，将这160只鸡再平均分成4小组，即每小组40只。每小组分别免疫1、1/4、1/8、1/16剂量的四联疫苗，0．5ml/只。免疫60天，采血，分离血清，分别检测抗NDV、IBV、EDSV和AIV(H9)的HI抗体。每小组的40只鸡再分成10只一组，各用NDV北京株（CVCC AV1611）、IBV M41株、EDS76V HS25株和AI(H9) HZ株分别攻毒，同时，设对照，每种病毒攻击10只。

二、效力检验结果

1.四联灭活疫苗ND免疫效力试验。接种四联疫苗后，ND组免疫组鸡HI抗体效价的几何平均值为1∶51．2，远高于欧盟和国家标准“1∶16”。结果见表1。

2.四联灭活疫苗IB免疫效力试验。试验表明，首免血清平均HI 抗体效价为1∶12．8；二免血清平均HI抗体效价为1∶67．2，二免血清HI抗体效价的几何平均值是首免血清的5．25倍。而此项国家标准为“3倍”，该疫苗的效价远高于国家标准。结果见表2。

3.四联灭活疫苗EDS免疫效力试验。试验表明，接种四联疫苗后，EDS组免疫组鸡HI抗体效价的几何平均值为1∶243．2，远高于国家标准“1∶128”，结果见表3。

表1 ND组效力试验HI抗体效价测定结果

表2 IB组效力试验HI抗体效价测定结果

表3 EDS组效力试验HI抗体效价测定结果

4.四联灭活疫苗AI(H9)免疫效力试验。试验表明，接种四联疫苗后，AI(H9)组免疫组鸡HI抗体效价的几何平均值为1∶134．4，远高于国家标准“1∶90”，结果见表4。免疫攻毒试验表明，经四联苗免疫的鸡，对AIV HZ株的攻毒保护率为100%，结果见表5。

5.四联灭活疫苗对SPF蛋鸡最小免疫剂量的确定。给130日龄SPF鸡接种不同剂量四联灭活疫苗，分别为正常免疫剂量（0．5 mL）的1、1/4、1/8和1/16，免疫60天采血，测ND和AI(H9)的HI抗体，并且分别攻毒。接种剂量为31．25 uL/只(0．5 mL的1/16)，ND的HI抗体效价最低为6．2 log2，攻毒保护率最低为90%，因此，四联疫苗中ND部分对SPF鸡的最小免疫剂量至少为31．25 uL，正常免疫剂量（0．5 mL）最低含16个最小免疫剂量。接种剂量为31．25 uL/只(0．5 mL的1/16)，AI(H9)的HI抗体效价最低为6．2 log2，攻毒保护最低为90%，因此，四联疫苗中AI(H9)部分对SPF鸡的最小免疫剂量至少为31．25 uL，正常免疫剂量（0．5 mL）最低含16个最小免疫剂量。结果见表6和表7。

给130日龄SPF鸡接种不同剂量四联灭活疫苗，分别为正常免疫剂量（0．5 mL）的1、1/4、1/8和1/16，免疫60天采血，测IB和EDS76的HI抗体，并且分别攻毒。接种剂量为62．5 uL/只(0．5 mL的1/8)，IB的HI抗体最低为1∶84．4，高于攻毒前抗体效价（1∶22．6）的3倍，相对产蛋率达到80%以上；而接种剂量为31．25 uL/只(0．5 mL的1/16)，IB的HI抗体最高为1∶42．2，低于攻毒前抗体效价（1∶22．6）的3倍，相对产蛋率低于80%，因此，四联疫苗中IB部分对SPF鸡的最小免疫剂量至少为62．5 uL，正常免疫剂量（0．5 mL）最低含8个最小免疫剂量。同样，对于EDS76，接种剂量为31．25 uL/只(0．5mL的1/16)，EDS76的HI抗体效价最低为6．1 log2，相对产蛋率达到80%以上，因此，四联疫苗中EDS76部分对SPF鸡的最小免疫剂量至少为31．25 uL，正常免疫剂量（0．5 mL）最低含16个最小免疫剂量。结果见表7。

表4 AI(H9)组效力试验HI抗体效价测定结果

表5 AI(H9)组免疫攻毒试验结果

表6 四联灭活疫苗ND和AI(H9)对SPF鸡最小免疫剂量的确定

三、讨论和结论

疫苗具有很好的免疫效力，均达到我国、发达国家和国际组织的标准，在疫苗免疫与现地试验中均可达到良好的免疫效果，并且进行了免疫攻毒试验，100%保护；四联灭活疫苗的4种抗原对产蛋鸡的最小免疫剂量是不同的。对于ND、EDS76和AI(H9)的最小免疫剂量最小，为31．25 uL，正常接种剂量（0．5 mL）至少含16个最小免疫剂量；而对于IB，最小免疫剂量为62．5 uL，正常接种剂量（0．5 mL）含8个最小免疫剂量，因此，综合考虑，四联疫苗对产蛋鸡的最小免疫剂量确定62．5 uL，正常接种剂量（0．5 mL）含8个最小免疫剂量。

通过以上的结果显示四联灭活

表7 四联灭活疫苗IB和EDS76对SPF鸡最小免疫剂量的确定1