AGR2在结直肠癌中的表达及意义

孟冠男， 杨照微，杨素丽，黄丽红，才子斌*，何成彦，郭宏华

(1.吉林大学第一医院 肿瘤中心，吉林 长春130021；2.吉林大学中日联谊医院)

AGR2在结直肠癌中的表达及意义

孟冠男1， 杨照微2，杨素丽2，黄丽红2，才子斌1*，何成彦2，郭宏华2

(1.吉林大学第一医院 肿瘤中心，吉林 长春130021；2.吉林大学中日联谊医院)

目的 初步探讨前梯度蛋白2(Anterior Gradient-2,AGR2)在结直肠癌组织中的表达及临床意义。用以定义新的结直肠癌的生物标志物。方法 结直肠癌组织与癌旁组织中蛋白质表达谱由二维色谱与质谱联用技术(LC-MS)完成，蛋白表达情况通过免疫印迹验证。结果 被筛选的结直肠癌组织和癌旁组织中的差异蛋白共39个，其中19个为上调表达蛋白。结论 AGR2在结直肠癌组织中表达上调，可能是新的结直肠癌的生物标志物。

结直肠癌；AGR2；二维色谱与质谱联用技术

(ChinJLabDiagn,2017,21:0389)

近年来，结直肠癌在中国的发病率逐年增高，在公众眼中已被视为常见肿瘤之一[1]。手术和化疗对于早期的结直肠癌的治疗具有较好的效果[2]。然而，由于对化疗不敏感且容易复发使得晚期结直肠癌患者的五年存活率只有50%[3]。因此，在结直肠癌进入晚期之前对其进行诊断对于提高结直肠癌的生存率显得尤为重要。在二维色谱与质谱联用技术筛选出的39个表达存在差异蛋白中，前梯度蛋白2(AGR2)是上调表达蛋白之一。研究显示，AGR2在细胞的生长增殖过程中扮演了重要角色。

1 材料与方法

1.1 研究对象 本实验所用标本来自吉林大学中日联谊医院，组织标本库取病理确诊为结直肠癌的证实为Dukes B期腺癌患者，患者术前未接受任何治疗，为接受手术治疗后的新鲜组织标本。所用癌旁正常组织为远离癌组织10厘米以上且位于癌组织上段。依据上述标准，取手术新鲜组织，冲洗，液氮速冻，-80℃保存。

1.2 方法 通过LC-MS/MS法筛选出的结直肠癌组织及癌旁正常组织中的39个有显著差异的蛋白质中选择上调蛋白AGR2做免疫印迹，从蛋白表达的角度验证前期实验的准确性。

1.3 主要试剂 N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TMED)、二硫代苏糖醇(DTT)、考马斯亮蓝、十二烷基磺酸钠(SDS)、溴酚蓝、苯甲基磺酰氟(PMSF)购于Sigma公司。碘代乙酰胺(IAM)、IPG预制胶条、矿物油、蛋白质定量试剂盒(RCDC Protein Assay Kit)购于Bio-Rad公司。TPCK修饰的测序级胰酶购自Promeg公司。Agilent 1200高效液相色谱仪购自美国Agilent公司，LTQXL离子肼质谱仪购自美国Thermo Fisher公司。

1.4 统计学处理 SEQUEST算法计算二维色谱与质谱联用图谱数据，均数±标准差(x—±s)表示实验中的数据，用SPSS11.0软件分析，统计学意义标准为P<0.05。

2 结果

2.1 结直肠癌组织与癌旁组织差异蛋白质的质谱分析 本实验的每个蛋白的丰度通过谱图数来衡量。衡量的标准如下：①两个样品中蛋白谱图数的差值≥72；②两个样品中蛋白谱图数的比值≥1。依据上述标准，对比分析数据中肿瘤组织与癌旁组织的蛋白，得到39个有显著差异的蛋白，本文以上调蛋白AGR2为中心进行论述，AGR2质谱结果见图1，图2。

图1 AGR2蛋白中序列肽段GWGDQLIWTQTYEEALYK的串联质谱图

图2 AGR2蛋白中序列肽段LAEQFVLLNLVYETTDK的串联质谱图

2.2 AGR2在结直肠癌组织与癌旁组织表达水平的比较 在上述实验中鉴定出的19个呈现上调表达的蛋白中选出AGR2做蛋白印迹实验，结果见图3。癌组织明显高于癌旁正常组织。

3 讨论

结直肠癌作为我国常见肿瘤之一，发病率逐年增加。其预后及存活率与疾病诊断的阶段密切相关。对于早期诊断的结直肠癌患者，其五年生存率高达82.9%[4]，而晚期诊断的五年生存率则只有50%。为了提高患者的生存率，探索可用于早期诊断和判断复发的方法意义深远。

图3 AGR2在结直肠癌及癌旁组织中的表达

近期的研究显示，AGR家族有三种亚基：AGR1,AGR2和AGR3。AGR2也叫做hAG-2或Gob-4，可编码长度为17kDa的分泌性蛋白，是人类与非洲爪蟾蜍蛋白(xenopus laevis pritein，XAG-2)的直系同源基因。蟾蜍胚胎中的XAG-2诱导了黏液腺的分化[5,6]，虽然AGR2 在人体内的功能尚不清楚，有研究显示AGR2 可以诱导细胞的迁移和肿瘤的增殖。通过抑制P53促进细胞的存活。增强了细胞的黏附和迁移能力。AGR2在一些生物学通路包括迁移和转移中有着重要的生物学功能[7,8]。AGR2在多种人类肿瘤中高表达，并且其高表达与转移表型及不良预后相关[9,10]。AGR2在氨基酸序列同源性的基础上被认为是二硫键异构酶(PDI)家族的一员,定位于内质网的一种分泌蛋白[10]，同时也存在于细胞核和细胞表面。在正常组织中，AGR2高表达于肺、气管、胃肠道以及包含粘蛋白分泌细胞或具有分泌功能的组织中[7]。AGR2既高表达于膀胱尿道上皮，又高表达于气管；AGR2高表达于肺癌但并没有高表达于尿路上皮癌。在前列腺癌、胰腺癌和乳腺癌中，AGR2的表达随肿瘤的分期而降低。有研究表明，AGR2可以通过促进从内质网到细胞表面的受体表达来调控表皮生长因子受体(EGFR)通路。在正常的胰腺组织中并没有发现AGR2的表达，但在早期胰腺炎中却因为EGFR信号通路的开启，诱导了AGR2在细胞表面的出现。EGFR的高表达增强了下游信号的传导；突变型EGFR受体能够持续活化EGFR；自分泌环的原有功能加强等。在恶性肿瘤中EGFR的过表达占有重要的位置，多种恶性肿瘤组织中都有EGFR的过表达。AGR2同时具有促进两栖动物和鱼组织的再生功能。AGR2作为细胞增殖、迁移的刺激因子为人们所熟悉，与化疗耐药性、转移、复发相关。分泌性AGR2与乳腺癌的转移和预后不良相关。并可以作为前列腺癌的肿瘤标志物。由上述趋势，我们推测AGR2的表达量与肿瘤的类型相关，并且在不同类型的肿瘤中AGR2扮演的角色可能也不同[11]。AGR2可作为合适的候选基因用以探索循环肿瘤细胞，进而探索其与不同肿瘤之间的关系。尽管大量研究显示AGR2的表达与结直肠癌患者的临床参数相关，但AGR2在癌症进展中所扮演的具体角色并不清楚。

本研究通过差异蛋白质组学筛选出的结直肠癌相关蛋白AGR2，并对其在结直肠癌组织和癌旁组织的表达情况通过免疫印迹的方法进行检测，发现AGR2在结直肠癌组织中表达明显增高，提示AGR2可能是结直肠癌新的生物标志物。

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Expression Significance of AGR2 in Colorectal Cancer

MENGGuan-nan,YANGZhao-wei，YANGSu-li，etal.

(OncologyDepartment,TheFirstHospitalofJilinUniversity,Changchun130021,China)

Objective Detect the expression of Anterior Gradient-2 in colorectal cancer and its clinical significance,to define new biomarkers of colorectal cancer.Methods colorectal cancer tissues and pericarcinous tissues were analyzed with liquid chromatography/mass spectrometry,Protein expression were verified by western-blot.Results The number of mitochondrial proteins detected from colorectal cancer tissues and pericarcinous tissues is 39 and 19 were overxpressed.Conclusion AGR2 is overexpressed in colorectal cancer tissues and is the potential biomarker of colorectal cancer.

Colorectal Cancer;Anterior Gradient-2;LC-MS

国家自然基金资助项目(81572082)；吉林省科技发展项目(20150101153jc,20140311092YY，20150101153，20150414015)

1007-4287(2017)03-0389-03

R735.3+5 R735.3+7

A

2016-12-19)

*通讯作者